Апоптоз. Определение

1007 0

Основная задача системы, регулирующей апоптоз, - держать эффекторные каспазы, демонтирующие клетки, в неактивном состоянии, но быстро переводить их в активную форму в ответ на минимальное действие соответствующих индукторов.

Функцию активации эффекторных каспаз берут на себя каспазы-индукторы, основными представителями которых являются каспаза 8 и каспаза 9.

Эти каспазы при обычном состоянии клетки неактивны, существуют в форме прокаспаз. Отсюда действие разнообразных проапоптотических сигналов направлено на активацию каспазы 8 и каспазы 9.

В соответствии с этим выделяют 2 типа ведущих сигнальных путей:

1) Повреждение ДНК, радиация, действие токсических агентов, действие глюкокортикоидов, прекращение цитокиновой регуляции, укорочение до критического уровня теломеров - активация каспазы 9;
2) Проапоптотические сигналы, возникающие при активации рецепторов «региона клеточной смерти» (например, Fas-R, TNF-R) - активация каспазы 8.

Рассмотрим последовательно каждый из этих путей, схематично представленных на рис. 1.4.

Сигнальные пути активации каспазы 9

Сенсором повреждения ДНК и нарушений в клеточном цикле является ген Р53.

Р53-ген

Ген Р53, располагающийся на коротком плече хромосомы 17, кодирует образование ядерного белка, состоящего из 393 аминокислот, с молекулярной массой 53 Kd. Тетрамер Р53 функционирует как транскрипционный фактор, связываясь своим карбоксильным окончанием со специфическими регионами генов-мишеней. Белок Р53 находится в цитоплазме в латентном состоянии.

В последние годы показано, что активация его происходит не только в ответ на поражение ДНК, но также может явиться и следствием многих других процессов, происходящих в клетке, в том числе активации онкогенов, гипоксии, дефиците питания, старении и других. Недаром этот ген получил у одних авторов название «Господин ночной сторож», а у других - «Хранитель генома».

При активации Р53 белок способен инициировать независимо друг от друга 2 программы:

Временную остановку клеточного цикла в G1/S фазе с помощью белка p21 WAF1 , ингибирующего циклинзависимые киназы
Стимуляцию апоптоза путем активации гена Вах - проапоптотического гена семьи Всl-2 и/или активации образования свободных форм кислорода, способствующих выходу цитохрома-С из митохондрий.

Появившиеся в последние годы экспериментальные данные с выключение генов позволяют предположить, что приоритетной для большинства клеток является программа временной остановки митотического цикла. Есть сведения и об участии Р53 в процессах репарации ДНК путем активации вновь открытого гена P53R2, кодирующего рибонуклеотид редуктазу. Программа апоптоза включается при невозможности клеткой репарировать ДНК во время «ареста» при прохождении митотического цикла и/или дефиците белка p21 WAF1 . В некоторых клетках генетически обусловлен приоритет программы апоптоза при активации Р53 гена.

Роль Р53 - тканезависимая. У мышей в эксперименте с выключением этого гена радиация не вызывала апоптоза в лимфоцитах, но в легочной ткани признаки апоптоза были ярко выражены.

Рисунок 1.4. Основные пути апоптоза. Вах, Bid - проапоптотические гены семьи Всl-2 . dATP - аденозинтрифосфорная кислота. APAF-1 - апоптотический протеазактивирующий фактор

На рисунке представлены основные пути апоптоза, реализующие проапоптотические сигналы двух основных типов: повреждение ДНК радиацией или цитотоксическими агентами) и активация рецепторов «региона клеточной смерти».

Повреждение ДНК вызывает активацию гена Р53. Дальнейшее прохождение апототического сигнала этого типа происходит через активацию проапоптотических генов семьи Всl-2 (Вах и Bid). Белки этих генов вызывают пермеабилизацию мембраны митохондрий и выход в цитозоль Цитохрома С, аденозинтрифосфорной кислоты (dATP) , апоптоз индуцирующего фактора (Aif) и ДНКазы. Цитохром С вместе с dATP активирует находящийся в цитозоле белок APAF-1, образуя апоптосому, в которой происходит активация каспазы-9. Последняя активирует каспазу-3 - основной «экзекьютор» каспазного каскада.

Вслед за этим активируются другие каспазы, протеазы и ДНКазы, происходит апоптоз. Высвобожденные из митохондрий Aif и ДНКаза выполняют дополнительный внекаспазный путь апоптоза, реализуют свою активность непосредственно в ядре.

Связывание рецепторов «региона клеточной смерти» с соответствующими лигандами приводит к активации каспазы 8, способной к независимой активации каспазы 3. На этом пути может происходить и дополнительное вовлечение семьи Всl-2 генов путем активации каспазой 8 белков гена Bid.

И все-таки основной функцией гена Р53 следует считать включение программы апоптоза при повреждении клеточного генома, что можно рассматривать как защитную реакцию организма от накопления генетически дефектных клеток. Снижение активности гена Р53 или мутация в нем, приводящая к потере способности к включению апоптоза, является серьезным фактором, предрасполагающим к возникновению опухолей и развитию резистентности к химиотерапии.

Мутация гена Р53 обнаруживается более чем в половине раковых опухолей, частота ее повышается при длительной химиотерапии. У детей мутация в гене Р53 чаще наблюдается при Т-ОЛЛ, составляя около 12% и всегда является прогностически неблагоприятным фактором.

Итак, ген Р53 необходим для реализации программы апоптоза при повреждении ДНК и токсических воздействиях на клетку. Как это видно на схеме (рис.4), следующим шагом в проведении проапоптотического сигнала по этому пути является включение семьи Всl-2 - генов.

Семья Bcl-2-генов

Интерес к апоптозу резко возрос в середине 80-х годов, когда было выявлено, что усиление активности онкогена Всl-2, являющееся следствием обычной для В-клеточной фоликулярной лимфомы человека транслокации t (14;18), приводит к образованию опухолевого клона не за счет усиления пролиферации, а вследствие повышения выживаемости опухолевых клеток.

Позднее было показано, что при этой транслокации онкоген Всl-2, изначально располагавшийся на хромосомном сегменте 18q21, сливается с локусом, кодирующим тяжелую цепь Ig на хромосоме 14q32, что приводит к его повышенной экспрессии. Молекулярно-генетические исследования последующего десятилетия показали, что в, так называемую, семью Всl-2 генов, картированных у человека на 18 хромосоме, входят и другие гены, экспрессирующие белки с противоположной функцией (см.табл.1.1).

Таблица 1.1. Состав семьи Всl-2 генов

* обозначает число консервативных последовательностей, известных как регионы, гомологичные Всl-2. **** - 4 региона (ВН1-ВН4); *** - 3 региона (ВН1-ВНЗ); ** - 2 региона (ВНЗ, ВН4); * - 1 регион (ВНЗ); СООН-концевой гидрофобный домен, ответственный за прикрепление белков к наружной пластинке митохондриальной мембраны.

В настоящее время клонировано 16 генов, составляющих эту семью. Белки, производные этих генов, объединяет схожий морфологический состав - каждый из них имеет хотя бы одну из 4-х консервативных аминокислотных последовательностей, характерных для Всl-2-гена. Эти последовательности известны как регионы, гомологичные Всl-2 (ВН1-ВН4). Функциональное значение этих регионов до конца неясно, но по мнению некоторых исследователей, именно они обеспечивают реактивные способности белкам этой семьи.

Как следует из представленных в табл.1.1. данных, только 6 из них оказывают, подобно основателю этой семьи - Всl-2 гену, антиапоптотическое действие: защищают клетки от широкого спектра физиологических и экспериментальных воздействий, направленных на индукцию апоптоза. К таким стимулам относятся повреждение ДНК, действие глюкокортикоидов, прекращение цитокиновой регуляции и др. Некоторые из белков этой группы имеют СООН-концевой гидрофобный регион, ответственный за прикрепление белков к наружной поверхности митохондриальной мембраны.

Остальные 10 членов семьи - Всl-2 вызывают апоптоз. Эти проапоптотические белки могут быть подразделены на 2 подгруппы в зависимости от числа ВН регионов, которыми они располагают. Первые 4 (см.табл.1.1.) имеют по 2-3 ВН-региона, в то время как у 6 остальных обнаруживается только один ВНЗ-регион. Именно с этим регионом связывают проапоптотическую функцию белков. Многие из проапоптотических белков также, как антиапоптотические белки этой семьи, имеют концевой гидрофобный домен, но в отличии от последних, не прикрепляются к митохондрии до получения проапоптотического сигнала.

Восприятие анти- или проапоптотических сигналов членами семьи Всl-2 происходит как на уровне генов (так, белок Р53 повышает экспрессию гена Вах) так и на уровне постранскрипционных белков (действие цитокинов). При этом между самими белками наблюдаются сложные взаимодействия иногда в антагонистической манере. В процессе этих взаимодействий про- и антиапоптотические протеины могут образовывать гомо- и гетеродимеры как внутри своей группы, так и с протеинами противоположной направленности действия (см.рис. 1.5). Некоторые связи между промоторами и супрессорами клеточной смерти высоко специфичны (например, Воk и Мс1-1), другие скорее случайны.

Рисунок 1.5. Способы взаимодействий между белками семьи Всl-2

Значение этих взаимодействий пока прояснено только в отношении проапоптотических белков, имеющих один ВНЗ домен. Эти белки способны реализовать свою проапоптотическую активность только в антагонистической манере, образуя гетеродимеры с антиапоптотическими белками семьи Всl-2. Это правило не распространяется на всех членов семьи; Bcl-xL например, для выражения своей антиапоптотической активности не требует связи с промотором клеточной смерти.

Рисунок 1.6. Предрасположенность к апоптозу. Отношение числа гомодимеров к гетеродимерам определяет предрасположенность к апоптозу

В результате многочисленных экспериментов к настоящему времени сложилось впечатление, что решение жить или умереть клетке принимается на уровне семьи Всl-2 на основании относительного преобладания активных супрессоровили промоторов апоптоза. Это положение схематично проиллюстрировано на рис. 1.6.

Как же происходит реализация этого решения, что необходимо для дальнейшего продвижения по сигнальному пути, конечным пунктом которого должна стать активация индукторной каспазы 9?

Про- и антиапоптотическое действие активированных белков семьи Всl-2 реализуется главным образом через модуляцию активности митохондрий.

Роль митохондрий в процессах апоптотической смерти клеток

Митохондрия - матрикс, образованный клеточными органеллами и окруженный двухслойной мембраной. Митохондрия содержит геном, способный кодировать ограниченное число РНК и белков, необходимых для ее функции, однако, большинство же компонентов митохондрии кодируются в ядре, а затем импортируются в нее. Роль митохондрий в поддержании жизни велика - они являются основным источником клеточной энергии, образуя АТФ из АДФ с помощью окислительного фосфорилирования. В то же время многие исследователи считают митохондрии ключевой фигурой апоптоза.

Это связано с тем, что митохондрии являются источником цитохрома С, АТФ, Са++, Аиф (апоптоз индуцирующий фактор) - компонентов, необходимых для дальнейшего продвижения апоптотического сигнала. Выход этих факторов из митохондрии осуществляется только при взаимодействии ее мембраны с активированными белками семьи Всl-2. Многое в этом процессе требует уточнения, однако, схематически его можно представить следующим образом. Активированные белки семьи Всl-2 своими СООН - гидрофобными основаниями, как якорями прикрепляются к наружной мембране митохондрий.

Происходит это в местах сближения наружной и внутренней мембран, где, по-видимому, физиологически существуют пермеабилизационные поры, называемые мегаканалами, с диаметром, не превышающим 2nm. Эти поры функционируют как сенсоры многих физиологических параметров и таким образом передают информацию об основных метаболических процессах, происходящих в клетке. Они являются каналами для Са2+, вольтажа, РН, активных форм О2, но не пропускают некоторые анионы и непроходимы для более крупных молекул Цитохрома С, АТФ и Аиф, необходимых для апоптоза.

Было показано, что проапоптотические белки семьи Всl-2 (Вах, Bad, Bak и др.), укоренившись в наружной мембране, вступают в соединение с ANT (adenin-nucleotid-translocator), встроенным во внутреннюю мембрану в этих локусах, образуя временно более крупные мегаканалы (диаметр 2,4-3 nm). По эти каналам в цитозоль клетки поступают Цитохром С, АТФ и апоптоз индуцирующий фактор. Антиапоптотические белки семьи Всl-2 не способны пермеабилизировать мембрану митохондрий, а по некоторым данным, напротив, закрывают уже существующие каналы, прерывая таким образом продвижение проапоптотического сигнала и защищая клетку от апоптоза. Каково назначение проапоптотических митохондриальных сигнальных молекул?

Цитохром-С - белок с молекулярной массой 15 kDa, кодируется ядерным геномом, синтезируется как апоцитохром С, импортируется в митохондрию, где прикрепляется к внутренней поверхности мембраны и выходит в цитозоль через мегаканалы, открытые для него проапоптотическими белками семьи Всl-2 (Вах, Bad, Bak и др.). Цитохром-С необходим для образования апоптосомы, где и происходит активация каспазы 9, которая затем, в свою очередь, активирует основную «киллерную» каспазу 3 (см.рис. 1.4). Так завершается сигнальный путь апоптоза, вызванный повреждением ДНК.

Апоптосома представляет собою комплекс APAF-1 (apoptotic protease activating factor), Цитохрома-С, каспазы-9 и АТФ. До соединения с Цитохромом С APAF-1 существует в цитозоле в неактвном состоянии. При отсутствии достаточного количества АТФ образование апоптосомы не происходит и гибель клетки идет по некротическому пути.

Вместе с Цитохромом-С и АТФ из митохондрий в цитозоль клетки выходит также АИФ (апоптоз индуцирующий фактор). Синтез этого фактора также кодируется ядерным геномом, преврашение в зрелую форму (белок с молекулярной массой 75 kDa) происходит в митохондрии. Выйдя из митохондрии, АИФ направляется в ядро клетки, где вызывает фрагментацию ДНК, напоминающую апоптоз. Оверэкспрессия Всl-2 препятствует выходу апоптоз индуцирующий фактор из митохондрий, но не его активности при введении АИФ в клетку в эксперименте. АИФ не требует цитозолевой активации, выделяется из митохондрии до Цитохрома-С и, возможно, способствует его выходу. Таким образом, апоптоз индуцирующий фактор является самостоятельным "киллерным" фактором, дублирует действие Цитохрома-С и каспаз при их блокировании.

Интересно, что в процессе апоптоза митохондрия не теряет своей целостности и не подвергается разрушению.

Перечисленные здесь события легли в основу гипотезы, по которой митохондрия представляется ключевой фигурой апоптоза. Однако существует и альтернативная гипотеза, считающая основным мотором апоптоза каскадную активацию каспаз, при этом высвобожденный из митохондрий Цитохром С является не инициатором, а лишь усилителем апоптотического каскада. Последние представления поддерживаются данными о том, что активность семьи Всl-2 может поддеживаться и без участия митохондрий. Показано, что антиапоптотические белки этой семьи могут образовывать в цитозоле комплекс с APAF-1, блокирующий его активность. Ингибиция этой связи проапоптотическими членами семьи Всl-2 высвобождает APAF-1 и разрешает ему активировать каспазу 9.

Сигнальный путь активации каспазы 8

Передача проапоптотического сигнала при связи лиганда с рецепторами региона клеточной смерти происходит поседством адапторных белков FADD/MORT1, чей N-терминальный регион (DED) в свою очередь связывается с аналогичным регионом прокаспазы-8, вызывая ее аутокаталитическую активацию (см.рис. 1.4 и рис. 1.7). При активации некоторых членов семьи TNF-рецепторов (в том числе, TNF-R1) используется дополнительный адапторный белок TRADD.

Рисунок 1.7. Апоптоз, индуцированный сигналом «региона клеточной смерти». FADD-fas-associated death domain (связанный с FAS регион клеточной смерти); TRADD-TNF- associated death domain (связанный cTNF-R регион клеточной смерти); DD - death domain (регион смерти); DED - death effector domain (регион исполнителя смерти); NF-kB, АР-1 - транскрипционные факторы, активирующие провоспалительные и иммуномодуляторные гены

Рецепторный путь клеточной смерти представляется более коротким, чем апоптотический каскад, инициированный повреждением ДНК и рассмотренный выше: посредством адаптерных молекул происходит активация каспазы 8, которая в свою очередь способна напрямую активировать каспазы-палачи. Но это только основная схема, в действительности этот сигнальный путь значительно более сложный и переплетается с другими механизмами апоптоза. Так, известно, что каспаза 8 способна активировать белок Bid, что приводит, как подробно описано выше, к выбросу Цитохрома С из митохондрий. И хотя ясно, что этот путь не требует активации митохондрий, вовлечение их в процесс усиливает рецептор-индуцированный апоптоз (см.рис. 1.4).

Этот же сигнальный путь с привлечением других адаптерных белков используется и для реализации других клеточных программ. Так, сигнал, прошедший через TNF-R1, может активировать также и транскрипторные факторы NF-kB и АР-1. Эти сигнальные молекулы вызывают активацию генов, обеспечивающих продукцию факторов воспаления. Таким образом при активации TNF-R клетка должна принять решение - совершить ли самоубийство или выжить для продукции провоспалительных цитокинов.

Последнее решение принимается лимфоцитами чаще, возможно, потому что транскрипционный фактор NF-kB тормозит апоптотические пути. На выбор клетки влияет, по-видимому, и клеточное сообщество. Этот пример подтверждает то, что одни и те же сигнальные пути используются для реализации различных клеточных программ, механизмы выбора и принятия решения остаются во многом неясными. Так, рецепторный путь клеточной смерти у лимфоцитов независим от семьи Всl-2-генов и не может быть подавлен их антиапоптотической активностью.

Активация же Р53 может приводить в некоторых клеточных системах к трансактивации генов, кодирующих рецепторы региона «клеточной смерти».

Таким образом, существуют различные, часто перекрещивающиеся пути и механизмы реализации апоптотической программы, зависящие от клеточного типа и специфики проапоптотического сигнала. Разнообразие и многовариантность сигнальных путей апоптоза обеспечивают клетке запасные возможности для осуществления столь важной для клетки программы и в то же время делают эту программу очень зависимой от множества внешних и внутренних воздействий.

Е.Б. Владимирская

В развитии апоптоза можно выделить три фазы. Суть первой из них - рецепция сигнала и начальные этапы его передачи; эта фаза обратима. Вторая фаза - активация каспаз - является ключевым событием в развитии апоптоза; она приводит к необратимым последствиям. Третья фаза состоит в реализации гибели клетки, запрограммированной на предыдущем этапе. Проявления первой фазы развития апоптоза многообразны. Вторая и третья фазы протекают более стандартно. По современным представлениям пути и механизмы запуска апоптоза сводятся к двум механизмам - рецепторному и митохондриальному, которые схематически отображены на рисунке 51.

Наиболее детально изучен рецепторный механизм включения апоптоза . На поверхности клеток могут экспрессироваться специализированные Рц, передающие сигналы к развитию апоптоза. Их общее обозначение –Рц «смерти» (death receptors - DR). Эти Рц относятся к семейству Рц фактора некроза опухоли (TNF). От других Рц этой группы они отличаются наличием в цитоплазматической части специального домена «смерти» (death domain - DD), необходимого для включения внутриклеточного сигнала, приводящего к развитию апоптоза. К настоящему времени описано 6 DR–Рц. Среди них наиболее известен Fas–Рц (АРО–1, CD95). Его лигандом служит тримерная молекула, относящаяся к семейству TNF - Fas–лиганд (FasL, CD178) . Известны мембранная и растворимая формы FasL, из которых первая является значительно более эффективным индуктором апоптоза клеток фенотипа CD95, чем вторая. К DR-семейству относится такжеTNF–R1 - Рц TNF 1–го типа (p55, CD120A), тогда как Рц 2–го типа (р75, CD120B) лишен домена «смерти» и непосредственно не включает апоптогенные сигналы . Лигандом для TNF–R1 служат молекулы семейства TNF - TNF a и лимфотоксин a (TNF b). Рц DR3 передает сигналы от недостаточно охарактеризованной молекулы DR3L (APO3-L). DR4 и DR5 служат Рц для молекулы TRAIL. Этот тример, также относящийся к семейству TNF, связывается, кроме того, с Рц-ловушками DcR1 и DcR2, обусловливающими разрушение TRAIL. В связи с этим TRAIL не играет существенной роли в индукции апоптоза нормальных клеток, однако он индуцирует апоптоз опухолевых клеток, на которых Рц-ловушки отсутствуют или экспрессируются слабо . Природа лиганда DR6 пока не установлена.

Во всех случаях взаимодействие тримерных лигандов с Рц приводит к тримеризации последних, что является обязательным условием их функционирования в качестве передатчиков апоптотических сигналов. При этом домены смерти приобретают способность взаимодействовать с аналогичными доменами адаптерных белков FADD (Fas–associated death domain) и TRADD(TNF–receptor death domain). FADD узнает домены смерти в составе прокаспазы 8 и, взаимодействуя с ними, обусловливает активацию каспазы 8. Результат действия TRADD аналогичен, но он реализуется через посредство FADD. Формирующиеся в результате указанных взаимодействий молекулярные комплексы называют DISC (Death–inducing signaling complex). Рецепторный путь включения апоптоза не требует синтеза РНК и белка de novo . Поскольку апоптоз при этом запускается путём активного воздействия на клеточные Рц, он обозначается как активный апоптоз.

Другая группа механизмов включения апоптоза реализуется в условиях дефицита ростовых факторов, когда клетка как бы предоставляется сама себе (апоптоз «по умолчанию» - рис. 51) . Данную форму апоптоза называют ещё пассивным апоптозом. Механизм пассивного апоптоза используется при гибели клеток под действием стрессорных факторов (в том числе облучения), глюкокортикоидов и ряда токсических агентов, например цитостатиков, применяемых в онкологической практике. В этих случаях основой апоптоза служат процессы, запускаемые в митохондриях и сводящиеся к повышению проницаемости их мембраны для проапоптотических факторов.

Рис . 51 . Развитие апоптоза : показаны два механизма включения апоптоза - обусловленный повышением проницаемости митохондрий (апоптоз «по умолчанию») и рецепторный («активационный»). Оба механизма приводят к реализации апоптоза по единому зффекторному механизму. TRAIL - лиганд, индуцирующий связанный с фактором некроза опухоли апоптоз; FasL - лиганд для РцFas (от Fas ligand); TNFRI - Рц для фактора некроза опухоли I (от TNF receptor I); DR - Рц «смерти» (от - Death receptor); FADD - домен «смерти» Рц Fas (от Fas–associated death domain);TRADD - домен «смерти» Рц для фактора некроза опухоли (от TNF–receptor associated death domain). Около значков, символизирующих факторы, указано их название. Сплошные стрелки означают превращения, пунктирные - влияния, штриховые - перемещения факторов. Пояснения в тексте.

Многие клетки (возможно большинство из них) нуждаются в специальных сигналах для поддержания своей жизнеспособности. Источником таких сигналов выживания обычно служат цитокины и контактные взаимодействия с окружающими клетками. В отсутствие сигналов выживания в клетке нарушается функция митохондрий, в частности механизмы гликолиза и дефосфорилирования АТФ. Поскольку АДФ и продукт гликолиза пируват необходимы для нормального осуществления окислительного фосфорилирования, транспорта электронов и создания градиента протонов, эти процессы нарушаются, что приводит к повреждению мембраны митохондрий .

Параллельно срабатывает механизм, который реализуется белками - продуктами протоонкогенов семейства Вс1–2 . Эти белки делятся на несколько групп. Часть белков содержат 3–4 ВН–домена (ВН - от Bcl–2 homology) и разделяется на анти–апоптотические (Bcl–2, Bcl–X L , Mcl–1 и т.д.) и про-апоптотические (Вах, Bak, Bcl–X S и т.д.) факторы. Особую группу составляют «только-ВН3»-белки («ВН3-only» - Bad, Bid, Bik, Bim, Noxa, Вbс3 и т.д.), которые, в соответствии с названием содержат только один ВН–домен - ВН3, а в остальном отличаются от белков рассматриваемого семейства. Именно «только-ВН3»-белкам, прежде всего Bim, мобилизуемому из цитоскелета, отводят роль пусковых факторов апоптоза по умолчанию . Экспрессия или активация «только-ВН3»-белков происходит в условиях дефицита цитокинов и других факторов выживания, а также при активации белка p53, являющегося сенсором разрывов ДНК (в последнем случае активируются «только-ВН3»–факторы Noxa и Вbс3) . «Только-ВН3»-белки блокируют анти–апоптотические факторы типа Bcl–2, образуя с ними димеры, и способствуют проявлению активности проапоптотических факторов. Ключевым проявлением активности последних является формирование трансмембранных пор, которые образуются в результате олигомеризации Вах и Вак, в норме подавляемой антиапоптотическими факторами.

Через поры в мембране митохондрий в цитозоль выходят цитохром С и фактор APAF–1 (Apoptose protease activation factor 1). APAF–1 освобождается из мембраны митохондрий: фактор Bikвытесняет его из гетеродимера с факторами Вс1–2 или BCL–X L , В составе которого он удерживается в мембране. APAF–1 и цитохром С в присутствии АТФ образуют комплекс с неактивной каспазой - прокаспазой 9. Этот комплекс называют апоптосомой. В ней под влиянием APAF–1, распознающего гомологичный домен в прокаспазе, происходит активация каспазы 9 . В отличие от рецепторного механизма реализация митохондриального пути включения апоптоза требует экспрессии ряда генов и синтеза de novo РНК и белка.

До активации каспаз процесс развития апоптоза обратим. Блокада распространения апоптотического сигнала по раным путям происходит по-разному. Рецепторный механизм апоптоза может быть прерван благодаря активации группы факторов FLIP (FLICE-inhibitory protein; FLICE - старое название каспазы 8), которые содержат эффекторные домены смерти, свойственные каспазе 8, но лишены её каталитического центра. В результате они конкурентно блокируют действие этой каспазы . Митохондриальный механизм включения апоптоза блокируется упоминавшимися выше антиапоптотическими факторами семейства Вс1–2, прежде всего самим Вс1–2 и Bcl–X L . Эффект Вс1–2 связан главным образом с его способностью связывать «только-ВН3»–факторы и предотвращать их стимулирующее действие на формирование комплексов Bax-Bak. Bcl–2 способен также связываться непосредственно с Вах и Вак, а также с Apaf–1. Эти механизмы препятствуют формированию трансмембранных пор в митохондриях и/или формированию апоптосом. Необходимо упомянуть также о «сфингомиелиновом реостате» - механизме контроля баланса пролиферации и апоптоза, осуществляемого метаболитами сфингомиелина, среди которых роль проапоптотического фактора принадлежит церамиду.

Итак, оба пути включения апоптоза приводят к активации каспаз. Каспазы - это группа цистеиновых протеаз, которые расщепляют полипептидную связь после остатков аспарагиновой кислоты. Различие отдельных каспаз по специфичности сводится к распознаванию различных тетрапептидов, прилегающих к месту разрыва с NH 2 –конца . Рецепторный путь приводит к активации каспазы 8 (реже - каспаз 2 и 10), митохондриальный - к активации каспазы 9. Эти ферменты относятся к группе инициаторных каспаз. В неактивной форме (прокаспазы) они содержат наряду с двумя протеазными доменами два домена смерти (прокаспазы 8 и 10) для взаимодействия с FADD и другими адаптерными белками или домен, рекрутирующий прокаспазу в состав апоптосомы (прокаспазы 9 и 2). Их активация является следствием агрегации, возникающей вследствие взаимодействия с адаптерными белками (FADD, Apaf–1) и вызывающей аутокаталитическое отщепление длинного N–концевого участка. В процессе активации молекулы происходит реорганизация доменов и формирование активного гетеродимера (тетрамер p18/р11-р18/р11 в случае каспазы 8, тример - в случае каспазы 9). После активации инициаторных каспаз процесс апоптоза становится необратимым.

Инициаторные каспазы вызывают частичный протеолиз (отщепление короткого про–домена) и вследствие этого активацию исполнительных или эффекторных каспаз - 3, 6 и 7. Наиболее важной и универсальной по своему участию в осуществлении апоптоза является каспаза 3 . Активная каспаза 3 -это димер p17/р12. Исполнительные каспазы формируются также при действии гранзима В - сериновой протеазы, транспортируемой в клетки–мишени из киллерных лимфоцитов (Т и NK).

Мишенями исполнительных каспаз служат многочисленные белки, значительная часть которых локализуется в ядре . Расщепление молекул–мишеней определяет весь спектр проявлений апоптоза. Одна из главных мишеней каспазы 3 - эндонуклеаза CAD (Caspase–activated DNase) активируется в результате расщепления ингибиторного субкомпонента. Активированная CADосуществляет деградацию ДНК, действуя на доступные для нее участки молекулы, расположенные между нуклеосомами. Расщепление той же каспазой ядерных ферментов PARP(Poly-ADP-Ribose Polymerase), а также ДНК–зависимой протеинкиназы блокирует процесс репарации ДНК. Действие каспаз на фактор ретинобластомы (Rb) и d –изоформу протеинкиназы С определяет нарушение контроля клеточного цикла. Расщепление киназ МNK–1 и FAK приводит к изменениям, имеющим следствием ослабление адгезионной способности клетки, а расщепление гельсолина и киназы РАК определяет характерные изменения клеточной морфологии.

Уже упоминалось, что клетки, подвергающиеся апоптозу, быстро фагоцитируются. Этому способствует экспрессия на поверхности апоптотических клеток ряда молекул, распознаваемых фагоцитами и облегчающих процесс фагоцитоза . Так, при апоптозе нарушается асимметрия мембраны, и фосфатидилсерин, в норме локализующийся на внутренней поверхности мембраны, оказывается экспонированным на поверхности. Он распознаётся молекулой CD14 макрофага и, возможно, другими Рц. Свободные остатки Сахаров, формирующиеся вследствие десиалирования мембранных гликоконъюгатов, распознаются мембранными лектинами фагоцитов. Тромбоспондин, который также появляется на поверхности апоптотических клеток, узнается молекулами адгезии - интегрином a 2 b 2 и CD36, через которые сигналы передаются внутрь фагоцитирующей клетки и активируют её метаболизм. Лизосомальная ДНКаза II довершает деградацию ДНК апоптотической клетки уже внутри фагоцита. Благодаря быстрому фагоцитозу и отсутствию выхода внутриклеточного содержимого в межклеточное пространство, погибающая клетка не «загрязняет» его и не вовлекает в процесс гибели соседние клетки, что составляет важное отличие апоптоза от некроза.

В связи с интенсивным фагоцитозом апоптотических клеток их трудно определить in situ . Идентификация процесса апоптоза не ограничивается регистрацией морфологических изменений клеток (это - слишком субъективный показатель). Она основана на ряде особенностей процесса, о которых говорилось выше (рис. 52). Большая часть методов определения апоптоза основывается на выявлении деградации ДНК. Ещё недавно в качестве основного и самого надежного метода определения апоптоза клеток использовался электрофорез фрагментов ДНК, экстрагируемых из клетки: для апоптоза характерна «лесенка», то есть наличие фрагментов, по протяженности кратных длине ДНК в нуклеосоме, что при электрофорезе проявляется в виде дискретных фракций . Для выявления нерепарированных разрывов ДНК используют TUNEL–метод (TdT–mediated dUTR-biotin Nick End Labeling), основанный на катализируемом терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT) подсоединении к свободному 3"–концу нити ДНК меченых нуклеотидов с последующим обнаружением меченых клеток иммуногистохимическими или цитофлуорометрическими методами . В качестве скрининг–метода используют цитофлуорометрическое выявление гиподиплоидных клеток (т.е. клеток, потерявших часть ДНК вследствие её деградации), с помощью окрашивания пропидия йодидом . Ещё один широко распространённый цитофлуорометрический метод определения апоптоза используется для обнаружения экспрессии клетками фосфатидилсерина, который способен связывать аннексии V, меченный флуорохромом . Комбинирование окрашивания аннексином и пропидия йодидом позволяет дифференцировать апоптотические и некротические клетки (только последние окрашиваются пропидием без предварительной фиксации).

Рис . 52 . Методы определения апоптоза . а - схемы электрофореграмм олигонуклеотидов, иллюстрирующие различные проявления деградации ДНК при апоптозе (слева - «лесенка», отражающая последствия межнуклеосомной деградации ДНК с формированием дискретных фракций) и некрозе (справа - сплошное пятно, отражающее неупорядоченную деградацию ДНК), б - гистограмма, полученная при цитофлуорометрическом анализе фиксированных клеток, окрашенных на ДНК пропидия йодидом. Основной пик соответствует диплоидным клеткам, пик справа - клеткам, находящимся в клеточном цикле, пик слева, отмеченный курсором М1 - гиподиплоидным клеткам, утратившим часть ДНК в результате апоптоза - 28,7% от общего числа, в - результаты цитофлуорометрического анализа нефиксированных клеток, окрашенных конъюгатом аннексина V с изотиоцианатом флуоресцеина (по оси абсцисс) и пропидия йодидом (по оси ординат). Жизнеспособные клетки присутствуют в левом нижнем квадранте. В правом нижнем квадранте содержатся клетки, подвергшиеся апоптозу (связывают аннексии V, но непроницаемы для пропидия йодида), в левом верхнем квадранте - клетки, подвергшиеся некрозу (непроницаемы для пропидия йодида, не связывают аннексии V), в правом верхнем квадранте - как полагают, клетки, подвергшиеся апоптозу, который перешел в некроз.

1) Рецепторный. Осуществляется с помощью «рецепторов смерти» при активирующем взаимодействии с соответствующими лигандами, большинство из которых относится к суперсемейству фактора некроза опухолей. Взаимодействие рецептора с лигандом приводит к активации адапторных белков, ассоциированных с «доменами смерти» (FADD - Fas-associated death domain, TRADD - TNF-R-associated death domain), и прокаспазы 8, продукт которой - каспаза 8 (инициаторная) активирует каспазу 3 (эффекторную), что, в свою очередь, обусловливает активацию эндонуклеаз, фрагментирующих ДНК.

2) Митохондриальный. Участие митохондрий в апоптозе обеспечивается присутствием в их матриксе и межмембранном пространстве большого количества биологически активных веществ (цитохрома С (Cyt С); прокаспаз 2, 3, 9; апоптозиндуцирующего фактора (AIF), обладающих выраженным апоптогенным действием. Фактором активации апоптоза является выход данных веществ в цитоплазму при снижении трансмембранного потенциала митохондрий вследствие открытия гигантских митохондриальных пор (выполняют роль Ca 2 +-, рН-, потенциал-, НАДФ2Н/НАДФ+- и редоксзависимых каналов) и повышения проницаемости митохондриальных мембран. К раскрытию пор приводят истощение в клетках восстановленного глутатиона, НАДФН, АТФ и АДФ, образование активных форм кислорода, разобщение окислительного фосфорилирования, увеличение содержания Ca 2 + в цитоплазме. Поступление межмембранных белков и активация апоптоза возможны также при разрыве наружной мембраны митохондрий вследствие гиперполяризации внутренней мембраны.

3) р53-опосредованный. p53 - многофункциональный белок, играющий важную роль в мониторинге сигналов о состоянии клетки, целостности ее генома, активности систем ДНК-репарации. Повреждение ДНК ведет к накоплению белка р53 в клетке. Это определяет остановку клеточного цикла в фазах G 1 и G 2 , предотвращает репликацию, активирует синтез и репарацию ДНК, а следовательно, создает условия для восстановления нативной структуры ДНК, препятствует появлению мутантных и анеуплоидных клеток в организме. В случае если имеется недостаточность систем ДНК-репарации и повреждения ДНК сохраняются, клетка подвергается апоптозу. В частности, белок р53 способен индуцировать транскрипцию таких апоптогенных факторов, как Bax, Fas- рецептор, DR-5 и др.

4) Перфорин-гранзимовый. Цитотоксические Т-лимфоциты (Т-киллеры) вызывают апоптоз клеток-мишеней (например, инфицированных клеток) с помощью белка перфорина. Полимеризуясь, перфорин образует в цитоплазматической мембране клеткимишени трансмембранные каналы, по которым внутрь клетки поступают секретируемые Т-киллером гранзимы (фрагментины) - смесь сериновых протеаз. Основным компонентом этой смеси является гранзим В - протеолитический фермент, активирующий каспазу 3.

Значение белков-регуляторов апоптоза в развитии организма и патологических процессах

Вcl-2 требуется для поддержания жизнеспособности лимфоцитов, меланоцитов, эпителия кишечника и клеток почек во время развития эмбриона.

Вcl-x необходим для ингибирования смерти клеток в эмбриогенезе, особенно в нервной системе.

Bax необходим для апоптоза тимоцитов и поддержания жизнеспособности сперматозоидов во время их развития.

р53 является геном супрессии опухолей, поэтому в эмбриогенезе особой роли не играет, но обязательно необходим для супрессии опухолевого роста.

Усиленный синтез белка, кодируемого bcl-2 геном, приводит к подавлению апоптоза и, соответственно, развитию опухолей; данный феномен обнаружен в клетках В-клеточной фолликулярной лимфомы.

При лимфопролиферативных заболеваниях и похожей на системную красную волчанку болезни у мышей наблюдается нарушение функции Fas-лиганда или Fas-рецептора.

Повышенный синтез Fas-лиганда предупреждает отторжение трансплантата.

Апоптоз является частью патологического процесса при инфицировании клетки аденовирусами, бакуловирусами, ВИЧ и вирусами гриппа.

Ингибирование апоптоза в клетке-хозяине наблюдается при персистировании инфекции, в латентном периоде, а при усиленной репликации аденовирусов, бакуловирусов, возможно герпесвирусов, вируса Эпштейн-Барра и ВИЧ наблюдается активация апоптоза в клетках иммунной системы, что способствует распространению вируса.

Возможно, будет полезно почитать: