Apoptoza. Definiție

1007 0

Sarcina principală a sistemului de reglare a apoptozei este- mențin caspazele efectoare care demontează celulele într-o stare inactivă, dar le transformă rapid într-o formă activă ca răspuns la acțiunea minimă a inductorilor corespunzători.

Funcția de activare a caspazelor efectoare este preluată de caspazele inductoare, ai căror reprezentanți principali sunt caspaza 8 și caspaza 9.

Aceste caspaze sunt inactive în starea normală a celulei și există sub formă de procaspaze. Prin urmare, acțiunea diferitelor semnale proapoptotice are ca scop activarea caspazei 8 și a caspazei 9.

În conformitate cu aceasta, există 2 tipuri de căi de semnalizare principale:

1) lezarea ADN-ului, radiații, acțiunea agenților toxici, acțiunea glucocorticoizilor, încetarea reglării citokinelor, scurtarea telomerilor la un nivel critic - activarea caspazei 9;
2) Semnale pro-apoptotice care decurg din activarea receptorilor „regiunii morții celulare” (de exemplu, Fas-R, TNF-R) - activarea caspazei 8.

Să luăm în considerare secvenţial fiecare dintre aceste căi, prezentate schematic în Fig. 1.4.

Căi de semnalizare pentru activarea caspazei 9

Gena P53 este un senzor al deteriorării ADN-ului și al tulburărilor ciclului celular.

gena P53

Gena P53, situată pe brațul scurt al cromozomului 17, codifică formarea unei proteine nucleare constând din 393 de aminoacizi cu o greutate moleculară de 53 Kd. Tetramerul P53 funcționează ca un factor de transcripție, legându-se cu capătul său carboxil de regiuni specifice ale genelor țintă. Proteina P53 se află în citoplasmă în stare latentă.

În ultimii ani, s-a demonstrat că activarea sa are loc nu numai ca răspuns la deteriorarea ADN-ului, ci poate fi și o consecință a multor alte procese care au loc în celulă, inclusiv activarea oncogenelor, hipoxia, deficiența nutrițională, îmbătrânirea și altele. Nu degeaba această genă a fost numită „Mr Night Watchman” de către unii autori, iar „Gardienul genomului” de către alții.

Când P53 este activat, proteina este capabilă să inițieze 2 programe independent unul de celălalt:

Oprirea temporară a ciclului celular în faza G1/S folosind proteina p21 WAF1, care inhibă kinazele dependente de ciclină
Stimularea apoptozei prin activarea genei Bax - o genă pro-apoptotică din familia Bcl-2 și/sau activarea formării formelor libere de oxigen, promovând eliberarea citocromului-C din mitocondrii.

Datele experimentale despre oprirea genelor care au apărut în ultimii ani sugerează că programul prioritar pentru majoritatea celulelor este oprirea temporară a ciclului mitotic. Există, de asemenea, informații despre participarea lui P53 la procesele de reparare a ADN-ului prin activarea genei P53R2 nou descoperite, care codifică ribonucleotid reductază. Programul de apoptoză este activat atunci când celula nu este capabilă să repare ADN-ul în timpul „opririi” în timpul ciclului mitotic și/sau al deficienței proteinei p21 WAF1. În unele celule, prioritatea programului de apoptoză la activarea genei P53 este determinată genetic.

Rolul lui P53 este dependent de țesut. La șoareci, într-un experiment cu oprirea acestei gene, radiația nu a provocat apoptoză în limfocite, dar în țesutul pulmonar semnele de apoptoză au fost clar pronunțate.

Figura 1.4. Principalele căi de apoptoză. Wah, Bid - familie de gene proapoptoticeВсl-2. dATP - acid adenozin trifosforic. APAF-1 - factor de activare a proteazei apoptotice

Figura prezintă principalele căi de apoptoză, care implementează semnale pro-apoptotice de două tipuri principale: deteriorarea ADN-ului prin radiații sau agenți citotoxici) și activarea receptorilor „regiunii morții celulare”.

Deteriorarea ADN-ului determină activarea genei P53. Trecerea ulterioară a acestui tip de semnal apototic are loc prin activarea genelor proapoptotice din familia Bcl-2 (Bax și Bid). Proteinele acestor gene determină permeabilizarea membranei mitocondriale și eliberarea citocromului C în citosol, acid adenozin trifosforic (dATP), factor de inducere a apoptozei (Aif) și DNază. Citocromul C, împreună cu dATP, activează proteina APAF-1 situată în citosol, formând un apoptozom în care este activată caspaza-9. Acesta din urmă activează caspaza-3, principalul „executor” al cascadei caspazei.

După aceasta, alte caspaze, proteaze și ADN-aze sunt activate și are loc apoptoza. Aif și DNaza eliberate din mitocondrii efectuează o cale suplimentară de apoptoză extra-caspazică și își realizează activitatea direct în nucleu.

Legarea receptorilor „regiunii morții celulare” cu liganzii corespunzători duce la activarea caspazei 8, care este capabilă de activarea independentă a caspazei 3. Pe această cale, poate apărea o implicare suplimentară a familiei de gene Bcl-2 prin activarea Proteinele genei Bid prin caspaza 8.

Și totuși, funcția principală a genei P53 ar trebui considerată activarea programului de apoptoză atunci când genomul celular este deteriorat, ceea ce poate fi considerat ca o reacție de protecție a organismului împotriva acumulării de celule defecte genetic. O scădere a activității genei P53 sau o mutație a acesteia, care duce la pierderea capacității de a iniția apoptoza, este un factor grav care predispune la apariția tumorilor și la dezvoltarea rezistenței la chimioterapie.

Mutația genei P53 se găsește în mai mult de jumătate din cazurile de cancer, iar frecvența acesteia crește odată cu chimioterapia pe termen lung. La copii, o mutație a genei P53 este observată mai des în T-ALL, reprezentând aproximativ 12% și este întotdeauna un factor de prognostic nefavorabil.

Deci, gena P53 este necesară pentru implementarea programului de apoptoză în cazul deteriorării ADN-ului și a efectelor toxice asupra celulei. După cum se poate observa în diagramă (Fig. 4), următorul pas în efectuarea unui semnal proapoptotic de-a lungul acestei căi este includerea familiei de gene Bcl-2.

Familia de gene Bcl-2

Interesul pentru apoptoză a crescut brusc la mijlocul anilor '80, când s-a descoperit că activitatea crescută a oncogenei Bcl-2, care este o consecință a translocației t(14;18), comună în limfomul folicular cu celule B umane, duce la formarea unei clone tumorale nu datorită proliferării crescute și datorită supraviețuirii crescute a celulelor tumorale.

S-a arătat mai târziu că în timpul acestei translocări, oncogena Bcl-2, localizată inițial pe segmentul cromozomial 18q21, fuzionează cu locusul care codifică lanțul greu de Ig de pe cromozomul 14q32, ceea ce duce la creșterea expresiei sale. Studiile genetice moleculare din următorul deceniu au arătat că așa-numita familie de gene Bcl-2 cartografiate pe cromozomul 18 la oameni include și alte gene care exprimă proteine cu funcție opusă (vezi Tabelul 1.1).

Tabelul 1.1. Componența familieiВсl-2genele

* denotă numărul de secvențe conservate cunoscute ca regiuni omoloage Bcl-2. **** - 4 regiuni (VN1-VN4); *** - 3 regiuni (VN1-VNZ); ** - 2 regiuni (VNZ, VN4); * - 1 regiune (VNZ); Domeniul hidrofob COOH-terminal responsabil pentru atașarea proteinelor la lamina exterioară a membranei mitocondriale.

În prezent, cele 16 gene care alcătuiesc această familie au fost clonate. Proteinele derivate din aceste gene au o compoziție morfologică similară - fiecare dintre ele are cel puțin una dintre cele 4 secvențe de aminoacizi conservate caracteristice genei Bcl-2. Aceste secvențe sunt cunoscute ca regiuni omoloage cu Bcl-2 (BH1-BH4). Semnificația funcțională a acestor regiuni nu este în întregime clară, dar, potrivit unor cercetători, ele oferă abilitățile reactive ale proteinelor acestei familii.

După cum rezultă din cele prezentate în tabelul 1.1. date, doar 6 dintre ei sunt, ca și fondatorul acestei familii - Gena Bcl-2, efect anti-apoptotic: protejează celulele de o gamă largă de influențe fiziologice și experimentale care vizează inducerea apoptozei. Astfel de stimuli includ deteriorarea ADN-ului, acțiunea glucocorticoizilor, încetarea reglării citokinelor etc. Unele dintre proteinele din acest grup au o regiune hidrofobă COOH-terminală responsabilă de atașarea proteinelor la suprafața exterioară a membranei mitocondriale.

Restul de 10 membri ai familiei Bcl-2 provoacă apoptoză. Aceste proteine proapoptotice pot fi împărțite în 2 subgrupe în funcție de numărul de regiuni VL pe care le au. Primele 4 (vezi Tabelul 1.1.) au 2-3 regiuni VN, în timp ce celelalte 6 au o singură regiune VZ. Cu această regiune este asociată funcția proapoptotică a proteinelor. Multe dintre proteinele proapoptotice, ca și proteinele antiapoptotice din această familie, au un domeniu hidrofob terminal, dar spre deosebire de acestea din urmă, ele nu se atașează la mitocondrie înainte de a primi un semnal proapoptotic.

Percepția semnalelor anti- sau proapoptotice de către membrii familiei Bcl-2 are loc atât la nivel de genă (de exemplu, proteina P53 crește expresia genei Bax), cât și la nivelul proteinelor post-transcripționale (acțiunea de citokine). În același timp, se observă interacțiuni complexe între proteinele în sine, uneori într-o manieră antagonistă. În timpul acestor interacțiuni, proteinele pro- și anti-apoptotice pot forma homo- și heterodimeri atât în cadrul propriului grup, cât și cu proteine din direcția opusă de acțiune (vezi Fig. 1.5). Unele conexiuni între promotori și supresori ai morții celulare sunt foarte specifice (de exemplu, Bok și Mc1-1), altele sunt destul de aleatorii.

Figura 1.5. Moduri de interacțiune între proteinele familieiВсl-2

Semnificația acestor interacțiuni a fost clarificată până acum doar în legătură cu proteinele proapoptotice care au un domeniu B3. Aceste proteine sunt capabile să-și realizeze activitatea proapoptotică doar într-o manieră antagonistă, formând heterodimeri cu proteine antiapoptotice din familia Bcl-2. Această regulă nu se aplică tuturor membrilor familiei; Bcl-xL, de exemplu, nu necesită legarea la promotorul morții celulare pentru a-și exprima activitatea antiapoptotică.

Figura 1.6. Predispoziție la apoptoză. Raportul dintre numărul de homodimeri și heterodimeri determină susceptibilitatea la apoptoză

Ca urmare a numeroaselor experimente până în prezent, se pare că decizia de a trăi sau de a muri pentru o celulă este luată la nivelul familiei Bcl-2 pe baza predominanței relative a supresoarelor active sau a promotorilor apoptozei. Această situație este ilustrată schematic în fig. 1.6.

Cum este pusă în aplicare această decizie, ceea ce este necesar pentru progrese suplimentare de-a lungul căii de semnalizare, al cărui punct final ar trebui să fie activarea inductorului caspazei 9?

Efectele pro- și anti-apoptotice ale proteinelor activate din familia Bcl-2 sunt realizate în principal prin modularea activității mitocondriale.

Rolul mitocondriilor în procesele de moarte celulară apoptotică

Mitocondriile- o matrice formata din organite celulare si inconjurata de o membrana cu doua straturi. Mitocondria conține un genom capabil să codifice un număr limitat de ARN și proteine necesare funcționării sale, cu toate acestea, majoritatea componentelor mitocondriei sunt codificate în nucleu și apoi importate în acesta. Rolul mitocondriilor în menținerea vieții este mare - sunt principala sursă de energie celulară, formând ATP din ADP folosind fosforilarea oxidativă. În același timp, mulți cercetători consideră mitocondriile un jucător cheie în apoptoză.

Acest lucru se datorează faptului că mitocondriile sunt o sursă de citocrom C, ATP, Ca++, AIF (factor de inducere a apoptozei)- componente necesare pentru promovarea în continuare a semnalului apoptotic. Eliberarea acestor factori din mitocondrie are loc numai atunci când membrana acestuia interacționează cu proteinele activate din familia Bcl-2. O mare parte din acest proces necesită clarificări, cu toate acestea, poate fi reprezentat schematic după cum urmează. Proteinele activate din familia Bcl-2 sunt atașate de membrana exterioară a mitocondriilor cu bazele lor COOH - hidrofobe, ca ancore.

Aceasta se întâmplă în locurile în care membranele exterioare și interioare se unesc, unde, aparent, fiziologic există pori de permeabilizare, numiți megacanale, cu un diametru care nu depășește 2 nm. Acești pori funcționează ca senzori pentru mulți parametri fiziologici și, astfel, transmit informații despre principalele procese metabolice care au loc în celulă. Sunt canale pentru Ca2+, tensiune, pH, forme active de O2, dar nu permit trecerea unor anioni și sunt impenetrabile pentru moleculele mai mari de Citocrom C, ATP și Aif, care sunt necesare pentru apoptoză.

S-a demonstrat că proteinele proapoptotice din familia Bcl-2 (Bax, Bad, Bak etc.), înrădăcinate în membrana exterioară, se combină cu ANT (adenin-nucleotid-translocator), încorporat în membrana internă la aceste loci, formând temporar megacanale mai mari (diametru 2,4-3 nm). Prin aceste canale, citocromul C, ATP și factorul care induce apoptoza intră în citosolul celular. Proteinele anti-apoptotice din familia Bcl-2 nu sunt capabile să permeabilizeze membrana mitocondrială, iar conform unor date, dimpotrivă, închid canalele existente, întrerupând astfel progresia semnalului pro-apoptotic și protejând celula de apoptoză. . Care este scopul moleculelor de semnalizare mitocondrială pro-apoptotică?

Citocromul-C- o proteina cu o greutate moleculara de 15 kDa, codificata de genomul nuclear, sintetizata ca apocitocrom C, importata in mitocondrie, unde se ataseaza de suprafata interioara a membranei si iese in citosol prin megacanale deschise pentru aceasta de proteinele proapoptotice din familia Bcl-2 (Bax, Bad, Bak etc.). Citocromul-C este necesar pentru formarea apoptozomului, unde este activată caspaza 9, care apoi, la rândul său, activează principala caspază „ucigașă” 3 (vezi Fig. 1.4). Acest lucru încheie calea de semnalizare apoptotică cauzată de deteriorarea ADN-ului.

Apoptozomul este un complex de APAF-1 (factor de activare a proteazei apoptotice), citocrom-C, caspază-9 și ATP. Înainte de a se combina cu citocromul C, APAF-1 există în citosol într-o stare inactivă. În absența unei cantități suficiente de ATP, formarea apoptozomului nu are loc și moartea celulară urmează o cale necrotică.

Împreună cu Citocromul-C și ATP, AIF (factorul de inducere a apoptozei) iese și din mitocondrii în citosolul celular. Sinteza acestui factor este, de asemenea, codificată de genomul nuclear, transformarea în forma matură (o proteină cu o greutate moleculară de 75 kDa) are loc în mitocondrii. După ce părăsește mitocondria, AIF călătorește către nucleul celulei, unde provoacă fragmentarea ADN-ului, care amintește de apoptoză. Supraexprimarea Bcl-2 previne eliberarea factorului care induce apoptoza din mitocondrii, dar nu și activitatea acestuia atunci când AIF este introdus în celulă în experiment. AIF nu necesită activare citosolică, este eliberată din mitocondrie în Citocromul-C și, eventual, contribuie la eliberarea acestuia. Astfel, factorul care induce apoptoza este un factor „ucigaș” independent, duplicând acțiunea citocromului-C și a caspazelor atunci când acestea sunt blocate.

Interesant este că în timpul procesului de apoptoză, mitocondriile nu își pierd integritatea și nu sunt distruse.

Evenimentele enumerate aici formează baza ipotezei că mitocondria pare a fi un jucător cheie în apoptoză. Cu toate acestea, există o ipoteză alternativă care consideră că activarea în cascadă a caspazelor este motorul principal al apoptozei, în timp ce Citocromul C eliberat din mitocondrii nu este un inițiator, ci doar un amplificator al cascadei apoptotice. Cele mai recente idei sunt susținute de date că activitatea familiei Bcl-2 poate fi susținută fără participarea mitocondriilor. S-a demonstrat că proteinele anti-apoptotice din această familie pot forma un complex cu APAF-1 în citosol, blocând activitatea acestuia. Inhibarea acestei asocieri de către membrii familiei Bcl-2 proapoptotice eliberează APAF-1 și îi permite să activeze caspaza 9.

Calea de semnalizare a activării caspazei 8

Transmiterea unui semnal pro-apoptotic atunci când un ligand se leagă de receptorii regiunii de moarte celulară are loc prin intermediul proteinelor adaptoare FADD/MORT1, a căror regiune N-terminală (DED) se leagă la rândul său de o regiune similară a procaspazei-8, determinând activarea sa autocatalitică (vezi Fig. 1.4 și Fig. .1.7). Când unii membri ai familiei de receptori TNF (inclusiv TNF-R1) sunt activați, este utilizată o proteină adaptor suplimentară, TRADD.

Figura 1.7. Apoptoza indusă de semnalul regiunii moarte celulară. Domeniul de moarte asociat FADD-fas (regiune de moarte celulară asociată cu FAS); Domeniul de moarte asociat cu TRADD-TNF (regiune de moarte celulară asociată cu cTNF-R); DD - domeniul morții (regiunea morții); DED - domeniul efectorului morții (regiunea executorului morții); NF-kB, AP-1 - factori de transcripție care activează genele proinflamatorii și imunomodulatorii

Calea receptorului de moarte celulară pare a fi mai scurtă decât cascada apoptotică inițiată de deteriorarea ADN-ului și discutată mai sus: caspaza 8 este activată prin molecule adaptoare, care la rândul lor pot activa direct caspazele călăului. Dar aceasta este doar schema de bază, în realitate, această cale de semnalizare este mult mai complexă și împletită cu alte mecanisme de apoptoză. Astfel, se știe că caspaza 8 este capabilă să activeze proteina Bid, ceea ce duce, așa cum este descris în detaliu mai sus, la eliberarea citocromului C din mitocondrii. Deși este clar că această cale nu necesită activarea mitocondriilor, implicarea lor în proces crește apoptoza indusă de receptor (vezi Fig. 1.4).

Aceeași cale de semnalizare, cu implicarea altor proteine adaptoare, este, de asemenea, utilizată pentru implementarea altor programe celulare. Astfel, semnalul care trece prin TNF-R1 poate activa și factorii de transcripție NF-kB și AP-1. Aceste molecule de semnalizare determină activarea genelor care produc factori inflamatori. Astfel, atunci când TNF-R este activat, celula trebuie să ia o decizie dacă să se sinucidă sau să supraviețuiască pentru a produce citokine proinflamatorii.

Ultima decizie este luată mai des de limfocite, posibil pentru că factorul de transcripție NF-kB inhibă căile apoptotice. Alegerea celulei este aparent influențată și de comunitatea celulară. Acest exemplu confirmă că aceleași căi de semnalizare sunt utilizate pentru a implementa diferite programe celulare, mecanismele de alegere și de luare a deciziilor rămân în mare parte neclare. Astfel, calea receptorului de moarte celulară în limfocite este independentă de familia de gene Bcl-2 și nu poate fi suprimată de activitatea lor antiapoptotică.

Activarea P53 poate duce în unele sisteme celulare la transactivarea genelor care codifică receptorii din regiunea „moartea celulară”.

Astfel, există căi și mecanisme diferite, adesea suprapuse, pentru implementarea programului apoptotic, în funcție de tipul de celulă și de specificul semnalului proapoptotic. Diversitatea și multivarianța căilor de semnalizare a apoptozei oferă celulei capacitatea de rezervă pentru a efectua un program atât de important pentru celulă și, în același timp, fac acest program foarte dependent de multe influențe externe și interne.

E.B. Vladimirskaya

Dezvoltarea apoptozei poate fi împărțită în trei faze. Esența primului dintre ele este recepția semnalului și etapele inițiale ale transmiterii acestuia; această fază este reversibilă. A doua fază, activarea caspazelor, este un eveniment cheie în dezvoltarea apoptozei; duce la consecințe ireversibile. A treia fază constă în implementarea morții celulare, programată în etapa anterioară. Manifestările primei faze de dezvoltare a apoptozei sunt diverse. Faza a doua și a treia se desfășoară mai standard. Conform conceptelor moderne, căile și mecanismele de declanșare a apoptozei sunt reduse la două mecanisme - receptor și mitocondrial, care sunt afișate schematic în Figura 51.

Mecanismul receptorului pentru declanșarea apoptozei a fost studiat în cele mai multe detalii. RC specializate pot fi exprimate pe suprafața celulei, transmițând semnale pentru dezvoltarea apoptozei. Denumirea lor generală este „receptorii morții” (DR). Aceste RC aparțin familiei RC a factorului de necroză tumorală (TNF). Ele diferă de alte RC din acest grup prin prezența în partea citoplasmatică a unui „domeniu de moarte” (DD) special, care este necesar pentru a activa semnalul intracelular care duce la dezvoltarea apoptozei. Până în prezent, au fost descrise 6 DR-Rc. Dintre acestea, cel mai faimos este Fas-Rc (APO-1, CD95). Ligandul său este o moleculă trimerică aparținând familiei TNF - Fas-ligand (FasL, CD178). Sunt cunoscute forme membranoase și solubile ale FasL, dintre care prima este un inductor semnificativ mai eficient al apoptozei celulelor cu fenotipul CD95 decât al doilea. Familia DR include, de asemenea, TNF-R1 - TNF PCR de tip 1 (p55, CD120A), în timp ce PCR de tip 2 (p75, CD120B) nu are un domeniu de „moarte” și nu include direct semnale apoptogene. Liganzii pentru TNF-R1 sunt molecule din familia TNF - TNF a și limfotoxina a (TNF b). DR3 rc transmite semnale de la o moleculă DR3L subcaracterizată (APO3-L). DR4 și DR5 servesc ca RC pentru molecula TRAIL. Acest trimer, aparținând de asemenea familiei TNF, se leagă și de capcanele PCR DcR1 și DcR2, care provoacă distrugerea TRAIL. În acest sens, TRAIL nu joacă un rol semnificativ în inducerea apoptozei celulelor normale, dar induce apoptoza celulelor tumorale în care capcanele RC sunt absente sau slab exprimate. Natura ligandului DR6 nu a fost încă stabilită.

În toate cazurile, interacțiunea liganzilor trimerici cu RC duce la trimerizarea acestora din urmă, ceea ce este o condiție prealabilă pentru funcționarea lor ca transmițători de semnale apoptotice. În acest caz, domeniile de moarte dobândesc capacitatea de a interacționa cu domenii similare ale proteinelor adaptoare FADD (domeniul de moarte asociat Fas) și TRADD (domeniul de moarte al receptorului TNF). FADD recunoaște domeniile morții din procaspaza 8 și, interacționând cu acestea, provoacă activarea caspazei 8. Rezultatul TRADD este similar, dar este realizat prin FADD. Complexele moleculare formate ca rezultat al acestor interacțiuni se numesc DISC (Death-inducing signaling complex). Calea receptorului pentru a permite apoptoza nu necesită sinteza de ARN și proteine de novo. Deoarece apoptoza este declanșată de un efect activ asupra RC celulare, este desemnată ca apoptoză activă.

Un alt grup de mecanisme de declanșare a apoptozei se realizează în condițiile deficienței factorilor de creștere, când celula este, parcă, lăsată singură (apoptoza „în mod implicit” - Fig. 51). Această formă de apoptoză se mai numește și apoptoză pasivă. Mecanismul apoptozei pasive este utilizat în timpul morții celulare sub influența factorilor de stres (inclusiv radiații), a glucocorticoizilor și a unui număr de agenți toxici, de exemplu citostaticele utilizate în practica oncologică. În aceste cazuri, la baza apoptozei se află procesele lansate în mitocondrii și reduse la o creștere a permeabilității membranei lor la factorii pro-apoptotici.

Orez. 51 . Dezvoltarea apoptozei: sunt prezentate două mecanisme de activare a apoptozei - cauzate de creșterea permeabilității mitocondriale (apoptoza „în mod implicit”) și a receptorului („activare”). Ambele mecanisme conduc la implementarea apoptozei conform unui singur mecanism efector. TRAIL este un ligand care induce apoptoza legată de factorul de necroză tumorală; FasL - ligand pentru РсFas (de la ligand Fas); TNFRI - RC pentru factorul de necroză tumorală I (de la receptorul TNF I); DR - RC de „moarte” (din - receptorul morții); FADD - domeniul „deces” al RC Fas (din domeniul decesului asociat cu Fas); În dreptul pictogramelor care simbolizează factorii, sunt indicate numele acestora. Săgețile continue înseamnă transformări, săgețile punctate înseamnă influențe, săgețile întrerupte înseamnă mișcări ale factorilor. Explicații în text.

Multe celule (poate cele mai multe dintre ele) necesită semnale speciale pentru a-și menține viabilitatea. Sursa unor astfel de semnale de supraviețuire sunt de obicei citokinele și interacțiunile de contact cu celulele din jur. În absența semnalelor de supraviețuire în celulă, funcția mitocondrială este afectată, în special mecanismele de glicoliză și defosforilarea ATP. Deoarece ADP și produsul glicolitic piruvat sunt necesare pentru implementarea normală a fosforilării oxidative, transportului de electroni și crearea unui gradient de protoni, aceste procese sunt perturbate, ducând la deteriorarea membranei mitocondriale.

În paralel, este declanșat un mecanism care este realizat de proteine - produse ale proto-oncogenelor din familia Bc1–2. Aceste proteine sunt împărțite în mai multe grupuri. Unele proteine conțin 3-4 domenii BH (BH - din omologia Bcl-2) și sunt împărțite în anti-apoptotice (Bcl-2, Bcl-X L, Mcl-1 etc.) și pro-apoptotice (Bax, Bak , Bcl–X S etc.) factori. Un grup special constă din proteine „doar BH3” („doar BH3” - Bad, Bid, Bik, Bim, Noxa, Bbc3 etc.), care, în conformitate cu numele, conțin un singur domeniu BH - BH3, iar în alte privințe ele diferă de proteinele familiei luate în considerare. Proteinele „doar BH3”, în primul rând Bim, mobilizate din citoschelet, au rolul de declanșatori impliciti ai apoptozei. Exprimarea sau activarea proteinelor „doar BH3” are loc în condiții de deficiență a citokinelor și a altor factori de supraviețuire, precum și în timpul activării proteinei p53, care este un senzor de rupere ADN (în ultimul caz, „numai BH3” factorii Noxa și Bbc3 sunt activați). Proteinele „doar BH3” blochează factorii anti-apoptotici precum Bcl-2, formând dimeri cu aceștia și promovează manifestarea activității factorilor pro-apoptotici. Manifestarea cheie a activității acestuia din urmă este formarea porilor transmembranari, care se formează ca urmare a oligomerizării Bax și Bac, care este în mod normal suprimată de factori anti-apoptotici.

Prin porii din membrana mitocondrială, citocromul C și APAF-1 (factorul de activare a proteazei apoptozei 1) intră în citosol. APAF-1 este eliberat din membrana mitocondrială: factorul Bik îl înlocuiește din heterodimer cu factorii Bc1-2 sau BCL-X L, în care este reținut în membrană. APAF–1 și citocromul C, în prezența ATP, formează un complex cu o caspază inactivă, procaspaza 9. Acest complex se numește apoptozom. În ea, sub influența APAF-1, care recunoaște domeniul omolog în procaspază, are loc activarea caspazei 9. Spre deosebire de mecanismul receptor, implementarea căii mitocondriale de apoptoză necesită exprimarea unui număr de gene și sinteza. de novo ARN și proteine.

Înainte de activarea caspazei, procesul de apoptoză este reversibil. Blocarea propagării semnalului apoptotic de-a lungul căilor plăgii are loc în moduri diferite. Mecanismul receptor al apoptozei poate fi întrerupt din cauza activării unui grup de factori FLIP (FLICE-inhibitory proteins; FLICE - denumirea veche a caspazei 8), care conțin domeniile de moarte efectoare caracteristice caspazei 8, dar lipsite de centrul său catalitic. . Drept urmare, blochează competitiv acțiunea acestei caspaze. Mecanismul mitocondrial de activare a apoptozei este blocat de factorii anti-apoptotici menționați mai sus din familia Bc1–2, în primul rând de către Bc1–2 însuși și Bcl–X L. Efectul Bc1–2 este asociat în principal cu capacitatea sa de a lega factorii „numai BH3” și de a preveni efectul lor de stimulare asupra formării complexelor Bax-Bak. Bcl-2 este, de asemenea, capabil să se lege direct de Bax și Bak, precum și de Apaf-1. Aceste mecanisme previn formarea porilor transmembranari în mitocondrii și/sau formarea apoptozomilor. De asemenea, este necesar să menționăm „reostatul sfingomielinei” - un mecanism de control al echilibrului proliferării și apoptozei efectuat de metaboliții sfingomielinei, printre care ceramida joacă rolul unui factor proapoptotic.

Deci, ambele căi de apoptoză duc la activarea caspazelor. Caspazele sunt un grup de cistein-proteaze care scindează legătura polipeptidică după resturile de acid aspartic. Diferența de specificitate între caspazele individuale se reduce la recunoașterea diferitelor tetrapeptide adiacente la locul rupturii cu capătul NH2. Calea receptorului duce la activarea caspazei 8 (mai puțin frecvent, caspazele 2 și 10), calea mitocondrială duce la activarea caspazei 9. Aceste enzime aparțin grupului de caspaze inițiatoare. În forma lor inactivă (procaspaze), ele conțin, împreună cu două domenii de protează, două domenii de moarte (procaspaze 8 și 10) pentru interacțiunea cu FADD și alte proteine adaptoare sau un domeniu care recrutează procaspaza în apoptozom (procaspazele 9 și 2). Activarea lor este o consecință a agregării care are loc ca urmare a interacțiunii cu proteinele adaptoare (FADD, Apaf-1) și provoacă scindarea autocatalitică a regiunii lungi N-terminale. În timpul activării moleculei, domeniile sunt reorganizate și se formează un heterodimer activ (p18/p11-p18/p11 tetramer în cazul caspazei 8, trimer în cazul caspazei 9). După activarea caspazelor inițiatoare, procesul de apoptoză devine ireversibil.

Caspazele inițiatoare provoacă proteoliză parțială (clivarea unui pro-domeniu scurt) și, ca urmare, activarea caspazelor executive sau efectoare 3, 6 și 7. Cea mai importantă și universală în participarea sa la apoptoză este caspaza 3. Caspaza 3 activă este un dimer p17/p12. Caspazele executive se formează și sub acțiunea granzimei B, o serin protează transportată către celulele țintă din limfocitele ucigașe (T și NK).

Țintele caspazelor executive sunt numeroase proteine, dintre care o parte semnificativă sunt localizate în nucleu. Scindarea moleculelor țintă determină întregul spectru de manifestări ale apoptozei. Una dintre țintele principale ale caspazei 3, endonucleaza CAD (Caspase-activated DNase), este activată ca urmare a scindării subcomponentei inhibitoare. CAD activat degradează ADN-ul acționând asupra regiunilor accesibile ale moleculei situate între nucleozomi. Scindarea enzimelor nucleare PARP (Poly-ADP-Ribose Polymerase) și protein kinazei dependente de ADN de către aceeași caspază blochează procesul de reparare a ADN-ului. Acțiunea caspazelor asupra factorului retinoblastom (Rb) și a d-izoformei proteinei kinazei C determină perturbarea controlului ciclului celular. Scindarea kinazelor MNK-1 și FAK duce la modificări care au ca rezultat o slăbire a aderenței celulare, iar scindarea gelsolinei și PAK kinazei determină modificări caracteristice în morfologia celulei.

S-a menționat deja că celulele care suferă apoptoză sunt fagocitate rapid. Acest lucru este facilitat de exprimarea pe suprafața celulelor apoptotice a unui număr de molecule recunoscute de fagocite și facilitând procesul de fagocitoză. Astfel, în timpul apoptozei, asimetria membranei este perturbată, iar la suprafață este expusă fosfatidilserina, localizată în mod normal pe suprafața interioară a membranei. Este recunoscut de molecula macrofagei CD14 și, eventual, de alte RC. Reziduurile de zahăr liber formate ca rezultat al dezialilării glicoconjugatelor membranare sunt recunoscute de lectinele membranare ale fagocitelor. Trombospondina, care apare și pe suprafața celulelor apoptotice, este recunoscută prin moleculele de adeziune - integrina a 2 b 2 și CD36, prin care semnalele sunt transmise în interiorul celulei fagocitare și activează metabolismul acesteia. ADNza lizozomală II completează degradarea ADN-ului celulei apoptotice deja în interiorul fagocitului. Datorită fagocitozei rapide și absenței eliberării conținutului intracelular în spațiul intercelular, celula muribundă nu o „contaminează” și nu implică celulele vecine în procesul morții, ceea ce reprezintă o diferență importantă între apoptoză și necroză.

Datorită fagocitozei intense a celulelor apoptotice, acestea sunt greu de identificat in situ. Identificarea procesului de apoptoză nu se limitează la înregistrarea modificărilor morfologice în celule (acesta este un indicator prea subiectiv). Se bazează pe o serie de caracteristici ale procesului discutate mai sus (Fig. 52). Majoritatea metodelor de determinare a apoptozei se bazează pe detectarea degradării ADN-ului. Până de curând, electroforeza fragmentelor de ADN extrase din celulă a fost folosită ca metodă principală și cea mai fiabilă pentru determinarea apoptozei celulare: apoptoza este caracterizată printr-o „scără”, adică prezența fragmentelor care sunt multipli ai lungimii ADN-ului. în nucleozom, care apare sub formă de fracții discrete în timpul electroforezei. Pentru a identifica rupturile de ADN nereparate, este utilizată metoda TUNEL (etichetarea finală a dUTR-biotina Nick End mediată de TdT), bazată pe atașarea catalizată de deoxinucleotidil transferază (TdT) a nucleotidelor marcate la capătul liber de 3" al catenei de ADN, urmată de detectarea celulelor marcate prin metode imunohistochimice sau citofluorometrice Ca metodă de screening, detectarea citofluorometrică a celulelor hipodiploide (adică celulele care au pierdut o parte din ADN din cauza degradării acestuia) este utilizată folosind colorarea cu iodură de propidiu pentru determinarea citofluorometrică este utilizată pentru a detecta expresia fosfatidilserinei de către celule, care este capabilă să lege anexările marcate cu fluorocrom V. Combinarea colorării cu anexă și iodură de propidiu permite diferențierea celulelor apoptotice și necrotice (doar acestea din urmă sunt colorate cu propidiu fără fixare prealabilă).

Orez. 52 . Metode pentru determinarea apoptozei. a - diagrame ale electroferogramelor oligonucleotidelor, care ilustrează diferite manifestări ale degradării ADN-ului în timpul apoptozei (în stânga - o „scără”, reflectând consecințele degradării ADN internucleozomal cu formarea de fracții discrete) și necroză (în dreapta - o pată solidă , reflectând degradarea dezordonată a ADN-ului), b - o histogramă obținută din analiza citofluorometrică a celulelor fixate colorate pentru ADN cu iodură de propidiu. Vârful principal corespunde celulelor diploide, vârful din dreapta - celule din ciclul celular, vârful din stânga, marcat cu cursorul M1 - celule hipodiploide care și-au pierdut o parte din ADN ca urmare a apoptozei - 28,7% din total, c - rezultatele analizei citofluorometrice a celulelor nefixate, colorat conjugat de anexină V cu izotiocianat de fluoresceină (de-a lungul axei absciselor) și iodură de propidiu (de-a lungul axei ordonatelor). Celulele viabile sunt prezente în cadranul din stânga jos. Cadranul drept inferior conține celule care au suferit apoptoză (se leagă la anexa V, dar sunt impermeabile la iodură de propidiu), cadranul superior stâng conține celule care au suferit necroză (impermeabile la iodură de propidiu, nu se leagă la anexa V), cadranul superior drept se crede că celulele suferă apoptoză, care se transformă în necroză.

1) Receptor. Se realizează folosind „receptori de moarte” prin interacțiunea activatoare cu liganzii corespunzători, dintre care majoritatea aparțin superfamiliei factorilor de necroză tumorală. Interacțiunea receptorului cu ligand duce la activarea proteinelor adaptoare asociate cu „domeniile morții” (FADD - Fas-associated death domain, TRADD - TNF-R-associated death domain) și procaspaza 8, al cărei produs, caspaza 8 (inițiator), activează caspaza 3 (efector), care, la rândul său, determină activarea endonucleazelor care fragmentează ADN-ul.

2) mitocondriale. Participarea mitocondriilor la apoptoză este asigurată de prezența în matricea și spațiul lor intermembranar a unui număr mare de substanțe biologic active (citocrom C (Cyt C); procaspaze 2, 3, 9; factor de inducere a apoptozei (AIF), care au un efect apoptogen pronunțat Factorul de activare pentru apoptoză este eliberarea acestor substanțe în citoplasmă cu scăderea potențialului transmembranar al mitocondriilor datorită deschiderii porilor mitocondriali giganți (jucând rolul de Ca 2 + -, pH -, potențial. -, NADP2H/NADP + - și canale dependente de redox) și o creștere a permeabilității membranelor mitocondriale Epuizarea glutationului redus în celule duce la deschiderea porilor, NADPH, ATP și ADP, formarea de specii reactive de oxigen. decuplarea fosforilării oxidative, o creștere a conținutului de Ca 2 + în citoplasmă. Intrarea proteinelor intermembranare și activarea apoptozei sunt posibile și atunci când membrana exterioară a mitocondriilor este ruptă din cauza hiperpolarizării membranei interne.

3) mediat de p53. p53 este o proteină multifuncțională care joacă un rol important în monitorizarea semnalelor despre starea celulei, integritatea genomului acesteia și activitatea sistemelor de reparare a ADN-ului. Deteriorarea ADN-ului duce la acumularea proteinei p53 în celulă. Aceasta determină oprirea ciclului celular în fazele G 1 și G 2, previne replicarea, activează sinteza și repararea ADN-ului și, prin urmare, creează condiții pentru refacerea structurii ADN-ului nativ și previne apariția celulelor mutante și aneuploide în organism. Dacă există o insuficiență a sistemelor de reparare a ADN-ului și deteriorarea ADN-ului persistă, celula suferă apoptoză. În special, proteina p53 este capabilă să inducă transcripția unor astfel de factori apoptogeni precum Bax, receptorul Fas, DR-5 etc.

4) Granzima perforină. Limfocitele T citotoxice (celulele T ucigașe) induc apoptoza celulelor țintă (de exemplu, celulele infectate) folosind proteina perforină. Polimerizantă, perforina formează canale transmembranare în membrana citoplasmatică a celulei țintă, prin care granzimele (fragmentine) secretate de T-killer - un amestec de serin proteaze - pătrund în celulă. Componenta principală a acestui amestec este granzima B, o enzimă proteolitică care activează caspaza 3.

Importanța proteinelor-regulatori ai apoptozei în dezvoltarea organismului și a proceselor patologice

Bcl-2 necesare pentru a menține viabilitatea limfocitelor, melanocitelor, epiteliului intestinal și a celulelor renale în timpul dezvoltării embrionare.

Вcl-x necesar pentru inhibarea morții celulare în embriogeneză, în special în sistemul nervos.

Bax necesare pentru apoptoza timocitelor și menținerea viabilității spermei în timpul dezvoltării lor.

p53 este o genă de supresie tumorală, prin urmare nu joacă un rol deosebit în embriogeneză, dar este absolut necesară pentru suprimarea creșterii tumorii.

Sinteza crescută a proteinei codificate de gena bcl-2 duce la suprimarea apoptozei și, în consecință, la dezvoltarea tumorilor; acest fenomen a fost găsit în celulele limfomului folicular cu celule B.

În bolile limfoproliferative și boala asemănătoare lupusului eritematos sistemic la șoareci, funcția ligandului Fas sau a receptorului Fas este afectată.

Sinteză crescută Ligand Fas previne respingerea transplantului.

Apoptoza face parte din procesul patologic atunci când celulele sunt infectate cu adenovirusuri, baculovirusuri, HIV și virusuri gripale.

Inhibarea apoptozei în celula gazdă se observă în timpul infecției persistente, în perioada latentă, iar cu replicarea îmbunătățită a adenovirusurilor, baculovirusurilor, eventual herpesvirusurilor, virusului Epstein-Barr și HIV, se observă activarea apoptozei în celulele sistemului imunitar, care contribuie la răspândirea virusului.

Ar putea fi util să citiți: