Apoptoz. Tanım

1007 0

Apoptozu düzenleyen sistemin ana görevi- Hücreleri inaktif bir durumda parçalayan efektör kaspazları tutun, ancak karşılık gelen indükleyicilerin minimum etkisine yanıt olarak bunları hızlı bir şekilde aktif bir forma dönüştürün.

Efektör kaspazların aktive edilmesi işlevi, ana temsilcileri kaspaz 8 ve kaspaz 9 olan indükleyici kaspazlar tarafından üstlenilir.

Bu kaspazlar hücrenin normal durumunda aktif değildir ve prokaspazlar formunda bulunur. Dolayısıyla çeşitli proapoptotik sinyallerin etkisi kaspaz 8 ve kaspaz 9'u aktive etmeyi amaçlamaktadır.

Buna göre 2 tip öncü sinyal yolu vardır:

1) DNA hasarı, radyasyon, toksik ajanların etkisi, glukokortikoidlerin etkisi, sitokin regülasyonunun durması, telomerlerin kritik seviyeye kısaltılması - kaspaz 9'un aktivasyonu;
2) "Hücre ölüm bölgesi" reseptörlerinin (örneğin Fas-R, TNF-R) aktivasyonundan kaynaklanan pro-apoptotik sinyaller - kaspaz 8'in aktivasyonu.

Şekil 2'de şematik olarak sunulan bu yolların her birini sırayla ele alalım. 1.4.

Kaspaz 9 aktivasyonu için sinyal yolları

P53 geni, DNA hasarının ve hücre döngüsündeki bozuklukların sensörüdür.

P53 geni

17. kromozomun kısa kolunda yer alan P53 geni, molekül ağırlığı 53 Kd olan, 393 amino asitten oluşan bir nükleer proteinin oluşumunu kodlar. P53 tetrameri, karboksil terminali ile hedef genlerin spesifik bölgelerine bağlanan bir transkripsiyon faktörü olarak işlev görür. P53 proteini sitoplazmada latent durumdadır.

Son yıllarda, aktivasyonunun sadece DNA hasarına yanıt olarak meydana gelmediği, aynı zamanda onkogenlerin aktivasyonu, hipoksi, beslenme eksikliği, yaşlanma ve diğerleri dahil olmak üzere hücrede meydana gelen diğer birçok sürecin sonucu olabileceği gösterilmiştir. Bu genin bazı yazarlar tarafından "Bay Gece Bekçisi", bazıları tarafından da "Genomun Koruyucusu" olarak adlandırılması boşuna değildir.

P53 aktive edildiğinde protein birbirinden bağımsız olarak 2 programı başlatabilir:

Sikline bağımlı kinazları inhibe eden p21 WAF1 proteini kullanılarak G1/S fazında hücre döngüsünün geçici olarak durdurulması
Bcl-2 ailesinden bir proapoptotik gen olan Bax genini aktive ederek ve/veya serbest oksijen formlarının oluşumunu aktive ederek mitokondriden sitokrom-C salınımını teşvik ederek apoptozun uyarılması.

Gen kapanmasıyla ilgili son yıllarda ortaya çıkan deneysel veriler, çoğu hücre için öncelikli programın mitotik döngüyü geçici olarak durdurmak olduğunu gösteriyor. Ayrıca P53'ün, ribonükleotid redüktazı kodlayan yeni keşfedilen P53R2 geninin aktivasyonu yoluyla DNA onarım süreçlerine katıldığına dair bilgiler de mevcut. Apoptoz programı, hücre mitotik döngü sırasındaki "tutuklama" sırasında DNA'yı onaramadığında ve/veya p21 WAF1 proteininin eksikliğinde aktive olur. Bazı hücrelerde P53 geninin aktivasyonu sonrasında apoptoz programının önceliği genetik olarak belirlenmektedir.

P53'ün rolü dokuya bağlıdır. Bu genin kapatıldığı bir deneyde farelerde radyasyon, lenfositlerde apoptoza neden olmadı, ancak akciğer dokusunda apoptoz belirtileri açıkça belirgindi.

Şekil 1.4. Apoptozun ana yolları. Wah, Bid - proapoptotik gen ailesiВсl-2. dATP - adenosin trifosforik asit. APAF-1 - apoptotik proteaz aktive edici faktör

Şekil, iki ana tipte pro-apoptotik sinyalleri uygulayan apoptozun ana yollarını göstermektedir: radyasyon veya sitotoksik ajanlardan kaynaklanan DNA hasarı ve "hücre ölümü bölgesi" reseptörlerinin aktivasyonu.

DNA hasarı P53 geninin aktivasyonuna neden olur. Bu tip apototik sinyalin daha fazla geçişi, Bcl-2 ailesinin (Bax ve Bid) proapoptotik genlerinin aktivasyonu yoluyla gerçekleşir. Bu genlerin proteinleri mitokondri zarının geçirgenleşmesine ve Sitokrom C'nin sitozole salınmasına neden olur, adenozin trifosforik asit (dATP), apoptoz indükleyici faktör (Aif) ve DNaz. Sitokrom C, dATP ile birlikte sitozolde bulunan APAF-1 proteinini aktive ederek kaspaz-9'un aktive edildiği bir apoptozom oluşturur. İkincisi, kaspaz kaskadının ana "yürütücüsü" olan kaspaz-3'ü aktive eder.

Bunu takiben diğer kaspazlar, proteazlar ve DNazlar aktive olur ve apoptoz meydana gelir. Mitokondriden salınan Aif ve DNase, apoptozun ek bir kaspaz dışı yolunu gerçekleştirir ve aktivitelerini doğrudan çekirdekte gerçekleştirir.

"Hücre ölüm bölgesi" reseptörlerinin karşılık gelen ligandlarla bağlanması, kaspaz 3'ün bağımsız aktivasyonunu gerçekleştirebilen kaspaz 8'in aktivasyonuna yol açar. Bu yol boyunca, Bcl-2 gen ailesinin ilave katılımı, kaspaz 3'ün aktivasyonu yoluyla meydana gelebilir. Gen proteinlerini kaspaz 8 ile teklif edin.

Yine de P53 geninin ana işlevi, hücresel genom hasar gördüğünde apoptoz programının aktivasyonu olarak düşünülmelidir; bu, genetik olarak kusurlu hücrelerin birikmesine karşı vücudun koruyucu bir reaksiyonu olarak düşünülebilir. P53 geninin aktivitesinde bir azalma veya içindeki bir mutasyon, apoptozu başlatma yeteneğinin kaybına yol açar, tümörlerin ortaya çıkmasına ve kemoterapiye direnç gelişmesine zemin hazırlayan ciddi bir faktördür.

P53 gen mutasyonu kanserlerin yarısından fazlasında bulunur ve uzun süreli kemoterapiyle sıklığı artar. Çocuklarda, P53 genindeki bir mutasyon T-ALL'da daha sık görülür, yaklaşık %12'ye karşılık gelir ve her zaman olumsuz bir prognostik faktördür.

Yani DNA hasarı ve hücreye toksik etki oluşması durumunda apoptoz programının uygulanabilmesi için P53 geni gereklidir. Diyagramda görülebileceği gibi (Şekil 4), bu yol boyunca proapoptotik bir sinyalin iletilmesindeki bir sonraki adım, Bcl-2 gen ailesinin dahil edilmesidir.

Bcl-2 gen ailesi

Apoptoza olan ilgi, insan B hücreli foliküler lenfomada yaygın olarak görülen t(14;18) translokasyonunun bir sonucu olan Bcl-2 onkogen aktivitesinin artmasının 80'li yılların ortalarında keskin bir şekilde arttı. Bir tümör klonunun oluşumu, çoğalmanın artmasından değil, tümör hücrelerinin hayatta kalma oranının artmasından kaynaklanmaktadır.

Daha sonra, bu translokasyon sırasında, orijinal olarak 18q21 kromozomal segmentinde bulunan Bcl-2 onkogeninin, 14q32 kromozomu üzerindeki Ig ağır zincirini kodlayan lokus ile birleşerek ekspresyonunun artmasına yol açtığı gösterilmiştir. Sonraki on yılın moleküler genetik çalışmaları, insanlarda 18. kromozomda haritalanan Bcl-2 genleri ailesinin aynı zamanda zıt işlevli proteinleri eksprese eden diğer genleri de içerdiğini gösterdi (bkz. Tablo 1.1).

Tablo 1.1. Aile kompozisyonuВсl-2genler

* Bcl-2 homolog bölgeleri olarak bilinen korunmuş dizilerin sayısını belirtir. **** - 4 bölge (VN1-VN4); *** - 3 bölge (VN1-VNZ); ** - 2 bölge (VNZ, VN4); * - 1 bölge (VNZ); Proteinlerin mitokondriyal membranın dış laminasına bağlanmasından sorumlu COOH terminali hidrofobik alanı.

Şu anda bu aileyi oluşturan 16 gen klonlanmıştır. Bu genlerden türetilen proteinler benzer bir morfolojik bileşime sahiptir; her biri Bcl-2 geninin karakteristik özelliği olan 4 korunmuş amino asit dizisinden en az birine sahiptir. Bu diziler Bcl-2'ye (BH1-BH4) homolog bölgeler olarak bilinir. Bu bölgelerin işlevsel önemi tam olarak açık değildir ancak bazı araştırmacılara göre bu aileye ait proteinlerin reaktif yeteneklerini sağlarlar.

Tablo 1.1'de sunulanlardan aşağıdaki gibidir. verilerden sadece 6 tanesi bu ailenin kurucusu gibi - Bcl-2 geni, anti-apoptotik etki: hücreleri apoptozu indüklemeyi amaçlayan çok çeşitli fizyolojik ve deneysel etkilerden korur. Bu tür uyaranlar arasında DNA hasarı, glukokortikoidlerin etkisi, sitokin regülasyonunun durması vb. yer alır. Bu gruptaki proteinlerin bazıları, proteinlerin mitokondriyal membranın dış yüzeyine bağlanmasından sorumlu bir COOH terminali hidrofobik bölgesine sahiptir.

Bcl-2 ailesinin geri kalan 10 üyesi apoptoza neden olur. Bu proapoptotik proteinler sahip oldukları VL bölgelerinin sayısına bağlı olarak 2 alt gruba ayrılabilir. İlk 4'ü (bkz. Tablo 1.1.) 2-3 VN bölgesine sahipken geri kalan 6'sı yalnızca bir VZ bölgesine sahiptir. Proteinlerin proapoptotik fonksiyonu bu bölgeyle ilişkilidir. Bu ailenin antiapoptotik proteinleri gibi proapoptotik proteinlerin çoğu, bir terminal hidrofobik alana sahiptir, ancak ikincisinden farklı olarak, bir proapoptotik sinyal almadan önce mitokondriye bağlanmazlar.

Bcl-2 ailesinin üyeleri tarafından anti- veya proapoptotik sinyallerin algılanması hem gen seviyesinde (örneğin, P53 proteini Bax geninin ekspresyonunu artırır) hem de transkripsiyon sonrası proteinler seviyesinde (mesela sitokinler). Aynı zamanda proteinlerin kendi aralarında da bazen antagonistik şekilde karmaşık etkileşimler gözlenir. Bu etkileşimler sırasında pro- ve anti-apoptotik proteinler, hem kendi grupları içinde hem de zıt etki yönüne sahip proteinlerle homo ve heterodimerler oluşturabilir (bkz. Şekil 1.5). Hücre ölümünün destekleyicileri ve baskılayıcıları arasındaki bazı bağlantılar oldukça spesifiktir (örneğin, Bok ve Mc1-1), diğerleri ise oldukça rastgeledir.

Şekil 1.5. Aile proteinleri arasındaki etkileşim modlarıВсl-2

Bu etkileşimlerin önemi şu ana kadar yalnızca bir B3 alanına sahip proapoptotik proteinlerle ilişkili olarak açıklığa kavuşturuldu. Bu proteinler proapoptotik aktivitelerini ancak antagonistik bir şekilde gerçekleştirebilmekte ve Bcl-2 ailesinin antiapoptotik proteinleri ile heterodimerler oluşturabilmektedirler. Bu kural tüm aile üyeleri için geçerli değildir; Örneğin Bcl-xL, antiapoptotik aktivitesini ifade etmek için hücre ölümü destekleyicisine bağlanmayı gerektirmez.

Şekil 1.6. Apoptoza yatkınlık. Homodimer sayısının heterodimer sayısına oranı apoptoza duyarlılığı belirler

Bugüne kadar yapılan çok sayıda deneyin sonucunda, bir hücre için yaşama veya ölme kararının, apoptozun aktif baskılayıcıları veya destekleyicilerinin göreceli baskınlığına dayalı olarak Bcl-2 ailesi düzeyinde verildiği görülmektedir. Bu durum Şekil 2'de şematik olarak gösterilmektedir. 1.6.

Bu karar nasıl uygulanır, son noktası indükleyici kaspaz 9'un aktivasyonu olması gereken sinyal yolu boyunca daha fazla ilerleme için ne gereklidir?

Bcl-2 ailesinin aktifleştirilmiş proteinlerinin pro- ve anti-apoptotik etkileri esas olarak mitokondriyal aktivitenin modülasyonu yoluyla gerçekleştirilir.

Apoptotik hücre ölümü süreçlerinde mitokondrinin rolü

Mitokondri- hücresel organellerden oluşan ve iki katmanlı bir zarla çevrelenen bir matris. Mitokondri, işlevi için gerekli olan sınırlı sayıda RNA ve proteini kodlayabilen bir genom içerir, ancak mitokondrinin çoğu bileşeni çekirdekte kodlanır ve daha sonra ona aktarılır. Mitokondrinin yaşamı sürdürmedeki rolü büyüktür - hücresel enerjinin ana kaynağıdırlar ve oksidatif fosforilasyon kullanarak ADP'den ATP oluştururlar. Aynı zamanda birçok araştırmacı mitokondrinin apoptozda anahtar rol oynadığını düşünüyor.

Bunun nedeni mitokondrinin sitokrom C, ATP, Ca++ kaynağı olmasıdır. AIF (apoptoz indükleyici faktör)- apoptotik sinyalin daha da desteklenmesi için gerekli bileşenler. Bu faktörlerin mitokondriden salınması, yalnızca zarının Bcl-2 ailesinin aktif proteinleriyle etkileşime girmesiyle gerçekleşir. Bu süreçteki çoğu şey açıklama gerektirir, ancak şematik olarak aşağıdaki gibi temsil edilebilir. Bcl-2 ailesinin aktifleştirilmiş proteinleri, mitokondrinin dış zarına COOH - hidrofobik bazları ile çapalar gibi bağlanır.

Bu, dış ve iç zarların bir araya geldiği yerlerde meydana gelir; burada fizyolojik olarak megakanal adı verilen ve çapı 2 nm'yi aşmayan geçirgenleştirme gözenekleri bulunur. Bu gözenekler birçok fizyolojik parametre için sensör görevi görür ve böylece hücrede meydana gelen ana metabolik süreçler hakkında bilgi taşır. Bunlar Ca2+, voltaj, pH, O2'nin aktif formları için kanallardır, ancak bazı anyonların geçmesine izin vermezler ve apoptoz için gerekli olan daha büyük Sitokrom C, ATP ve Aif molekülleri için geçilmezdirler.

Dış zarda köklenen Bcl-2 ailesinin (Bax, Bad, Bak, vb.) proapoptotik proteinlerinin, bu lokuslarda iç zara yerleşik ANT (adenin-nükleotid-translokatör) ile birleşerek oluştuğu gösterilmiştir. geçici olarak daha büyük megakanallar (çap 2,4-3 nm). Bu kanallar aracılığıyla Sitokrom C, ATP ve apoptozu indükleyen faktör hücre sitozolüne girer. Bcl-2 ailesinin antiapoptotik proteinleri mitokondri zarını geçirgenleştirememekte, bazı verilere göre ise tam tersine mevcut kanalları kapatarak proapoptotik sinyalin ilerleyişini kesintiye uğratmakta ve hücreyi apoptozdan korumaktadır. . Proapoptotik mitokondriyal sinyal moleküllerinin amacı nedir?

Sitokrom-C- nükleer genom tarafından kodlanan, apositokrom C olarak sentezlenen, mitokondriye aktarılan, burada zarın iç yüzeyine bağlanıp proapoptotik proteinler tarafından kendisi için açılan megakanallar yoluyla sitozole çıkan, moleküler ağırlığı 15 kDa olan bir protein Bcl-2 ailesinden (Bax, Bad, Bak vb.). Sitokrom-C, kaspaz 9'un etkinleştirildiği apoptozomun oluşumu için gereklidir ve bu daha sonra ana "öldürücü" kaspaz 3'ü etkinleştirir (bkz. Şekil 1.4). Bu, DNA hasarının neden olduğu apoptotik sinyal yolunu sona erdirir.

Apoptozom, APAF-1 (apoptotik proteaz aktive edici faktör), Sitokrom-C, kaspaz-9 ve ATP'den oluşan bir komplekstir. APAF-1, Sitokrom C ile birleşmeden önce sitozolde inaktif bir durumda bulunur. Yeterli miktarda ATP olmadığında apoptozom oluşumu gerçekleşmez ve hücre ölümü nekrotik bir yol izler.

Sitokrom-C ve ATP ile birlikte AIF (apoptoz indükleyici faktör) de mitokondriden hücre sitozolüne çıkar. Bu faktörün sentezi aynı zamanda nükleer genom tarafından da kodlanır; mitokondride olgun forma (75 kDa moleküler ağırlığa sahip bir protein) dönüşüm meydana gelir. AIF, mitokondriyi terk ettikten sonra hücre çekirdeğine gider ve burada apoptozu anımsatan DNA parçalanmasına neden olur. Bcl-2'nin aşırı ekspresyonu, apoptoz tetikleyici faktörün mitokondriden salınmasını önler, ancak deneyde hücreye AIF eklendiğinde aktivitesini engellemez. AIF sitozolik aktivasyon gerektirmez, mitokondriden Sitokrom-C'ye salınır ve muhtemelen salınmasına katkıda bulunur. Dolayısıyla apoptozu tetikleyen faktör, bloke olduklarında Sitokrom-C ve kaspazların etkisini kopyalayan bağımsız bir "öldürücü" faktördür.

İlginçtir ki apoptoz sürecinde mitokondri bütünlüğünü kaybetmez ve yok edilmez.

Burada listelenen olaylar, mitokondrinin apoptozda anahtar rol oynadığı hipotezinin temelini oluşturmaktadır. Bununla birlikte, kaspazların kademeli aktivasyonunun apoptozun ana motoru olduğunu, mitokondriden salınan Sitokrom C'nin ise apoptotik kaskatın bir başlatıcısı değil, yalnızca bir yükselticisi olduğunu düşünen alternatif bir hipotez vardır. En son fikirler, Bcl-2 ailesinin aktivitesinin mitokondri katılımı olmadan desteklenebileceğine dair verilerle desteklenmektedir. Bu ailenin anti-apoptotik proteinlerinin, sitozolde APAF-1 ile bir kompleks oluşturarak aktivitesini bloke edebildiği gösterilmiştir. Bu ilişkinin proapoptotik Bcl-2 ailesi üyeleri tarafından inhibisyonu, APAF-1'i serbest bırakır ve kaspaz 9'u aktive etmesine izin verir.

Kaspaz 8 aktivasyon sinyal yolu

Bir ligand hücre ölümü bölgesinin reseptörlerine bağlandığında pro-apoptotik sinyalin iletimi, N-terminal bölgesi (DED) prokaspaz-8'in benzer bir bölgesine bağlanan adaptör proteinler FADD/MORT1 aracılığıyla gerçekleşir. otokatalitik aktivasyonu (bkz. Şekil 1.4 ve Şekil 1.7). TNF reseptör ailesinin bazı üyeleri (TNF-R1 dahil) aktive edildiğinde ek bir adaptör protein olan TRADD kullanılır.

Şekil 1.7. Hücre ölüm bölgesi sinyalinin neden olduğu apoptoz. FADD-fas ile ilişkili ölüm alanı (FAS ile ilişkili hücre ölümü bölgesi); TRADD-TNF ile ilişkili ölüm alanı (cTNF-R ile ilişkili hücre ölümü bölgesi); DD - ölüm alanı (ölüm bölgesi); DED - ölüm efektör alanı (ölüm uygulayıcısının bölgesi); NF-kB, AP-1 - proinflamatuar ve immünomodülatör genleri aktive eden transkripsiyon faktörleri

Hücre ölümünün reseptör yolu, DNA hasarı ile başlatılan ve yukarıda tartışılan apoptotik kaskaddan daha kısa gibi görünmektedir: kaspaz 8, adaptör moleküller yoluyla aktive edilir ve bu da, uygulayıcı kaspazları doğrudan aktive edebilir. Ancak bu yalnızca temel şemadır; gerçekte bu sinyal yolu çok daha karmaşıktır ve diğer apoptoz mekanizmalarıyla iç içe geçmiştir. Dolayısıyla kaspaz 8'in, yukarıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, Sitokrom C'nin mitokondriden salınmasına yol açan Bid proteinini aktive edebildiği bilinmektedir. Bu yolun mitokondri aktivasyonunu gerektirmediği açık olmasına rağmen, mitokondrilerin sürece dahil olması reseptör kaynaklı apoptozu arttırır (bkz. Şekil 1.4).

Diğer adaptör proteinlerin katılımıyla aynı sinyal yolu, diğer hücresel programların uygulanması için de kullanılır. Böylece TNF-R1'den geçen sinyal aynı zamanda NF-kB ve AP-1 transkripsiyon faktörlerini de aktive edebilir. Bu sinyal molekülleri, inflamatuar faktörler üreten genlerin aktivasyonuna neden olur. Bu nedenle, TNF-R aktive edildiğinde hücrenin intihar mı edeceği yoksa proinflamatuar sitokinler üretmek için hayatta mı kalacağı konusunda bir karar vermesi gerekir.

İkinci karar, muhtemelen transkripsiyon faktörü NF-kB'nin apoptotik yolları inhibe etmesi nedeniyle lenfositler tarafından daha sık verilir. Görünüşe göre hücre seçimi hücresel topluluktan da etkileniyor. Bu örnek, farklı hücresel programları uygulamak için aynı sinyal yollarının kullanıldığını doğrulamaktadır; seçim ve karar verme mekanizmaları büyük ölçüde belirsizliğini koruyor. Bu nedenle, lenfositlerdeki hücre ölümünün reseptör yolu, Bcl-2 gen ailesinden bağımsızdır ve antiapoptotik aktiviteleriyle baskılanamaz.

P53'ün aktivasyonu, bazı hücresel sistemlerde "hücre ölümü" bölgesinin reseptörlerini kodlayan genlerin transaktivasyonuna yol açabilir.

Bu nedenle, hücre tipine ve proapoptotik sinyalin özgüllüğüne bağlı olarak apoptotik programın uygulanmasına yönelik farklı, sıklıkla örtüşen yollar ve mekanizmalar vardır. Apoptoz sinyal yollarının çeşitliliği ve çok değişkenliği, hücreye, hücre için böylesine önemli bir programı yürütebilecek yedek kapasite sağlar ve aynı zamanda bu programı birçok dış ve iç etkiye oldukça bağımlı hale getirir.

E.B. Vladimirskaya

Apoptozun gelişimi üç aşamaya ayrılabilir. Bunlardan ilkinin özü, sinyal alımı ve iletiminin ilk aşamalarıdır; bu aşama geri dönüşümlüdür. İkinci aşama olan kaspazların aktivasyonu apoptoz gelişiminde anahtar bir olaydır; geri dönüşü olmayan sonuçlara yol açar. Üçüncü aşama, önceki aşamada programlanan hücre ölümünün uygulanmasından oluşur. Apoptoz gelişiminin ilk aşamasının belirtileri çeşitlidir. İkinci ve üçüncü aşamalar daha standart bir şekilde ilerliyor. Modern kavramlara göre apoptozu tetikleyen yollar ve mekanizmalar, Şekil 51'de şematik olarak gösterilen reseptör ve mitokondriyal olmak üzere iki mekanizmaya indirgenmiştir.

Apoptozu tetikleyen reseptör mekanizması en detaylı şekilde incelenmiştir. Özel RC'ler hücre yüzeyinde eksprese edilebilir ve apoptoz gelişimi için sinyaller iletilebilir. Genel adları “ölüm reseptörleri”dir (DR). Bu RC'ler tümör nekroz faktörü (TNF) RC ailesine aittir. Bu grubun diğer RC'lerinden, apoptozun gelişmesine yol açan hücre içi sinyali açmak için gerekli olan özel bir "ölüm alanının" (DD) sitoplazmik kısmındaki varlığıyla farklılık gösterirler. Bugüne kadar 6 DR-Rc tanımlanmıştır. Bunların arasında en ünlüsü Fas-Rc'dir (APO-1, CD95). Ligandı, TNF ailesine ait olan trimerik bir moleküldür - Fas-ligandı (FasL, CD178). FasL'nin membranlı ve çözünür formları bilinmektedir; bunlardan birincisi, ikinciye göre CD95 fenotipindeki hücrelerin apoptozunun önemli ölçüde daha etkili bir indükleyicisidir. DR ailesi aynı zamanda TNF-R1 - tip 1 TNF PCR'yi (p55, CD120A) içerirken tip 2 PCR (p75, CD120B) bir "ölüm" alanına sahip değildir ve doğrudan apoptojenik sinyalleri içermez. TNF-R1'e yönelik ligandlar, TNF ailesinin molekülleridir - TNF a ve lenfotoksin a (TNF b). DR3 rc, yeterince tanımlanmamış bir DR3L molekülünden (APO3-L) sinyaller iletir. DR4 ve DR5, TRAIL molekülü için RC'ler olarak görev yapar. Yine TNF ailesine ait olan bu trimer aynı zamanda TRAIL'in yok olmasına neden olan PCR tuzakları DcR1 ve DcR2'ye de bağlanır. Bu bağlamda TRAIL, normal hücrelerin apoptozunun indüklenmesinde önemli bir rol oynamaz, ancak RC tuzaklarının bulunmadığı veya zayıf bir şekilde eksprese edildiği tümör hücrelerinin apoptozunu indükler. DR6 ligandının doğası henüz belirlenmemiştir.

Her durumda, trimerik ligandların RC ile etkileşimi, bunların apoptotik sinyallerin vericileri olarak işlev görmeleri için bir ön koşul olan ikincisinin trimerizasyonuna yol açar. Bu durumda ölüm alanları, adaptör proteinleri FADD (Fas ile ilişkili ölüm alanı) ve TRADD'nin (TNF-reseptör ölüm alanı) benzer alanları ile etkileşime girme yeteneği kazanır. FADD, procaspase 8'deki ölüm alanlarını tanır ve bunlarla etkileşime girerek kaspaz 8'in aktivasyonuna neden olur. TRADD'nin sonucu benzerdir ancak FADD aracılığıyla gerçekleştirilir. Bu etkileşimler sonucunda oluşan moleküler komplekslere DISC (Ölüm-indükleyen sinyal kompleksi) adı verilmektedir. Apoptozu mümkün kılan reseptör yolu, RNA ve protein sentezi gerektirmez yeni. Apoptoz, hücresel RC'ler üzerindeki aktif etkiyle tetiklendiğinden aktif apoptoz olarak adlandırılır.

Apoptozu tetikleyen başka bir mekanizma grubu, büyüme faktörlerinin eksikliği koşulları altında, hücre kendi başına bırakıldığında ("varsayılan olarak apoptoz - Şekil 51) gerçekleştirilir. Bu apoptoz şekline pasif apoptoz da denir. Pasif apoptoz mekanizması, stres faktörlerinin (radyasyon dahil), glukokortikoidlerin ve bir dizi toksik maddenin, örneğin onkolojik uygulamada kullanılan sitostatiklerin etkisi altında hücre ölümü sırasında kullanılır. Bu durumlarda apoptozun temeli, mitokondride başlatılan ve membranlarının proapoptotik faktörlere karşı geçirgenliğinde bir artışa indirgenen süreçlerdir.

Pirinç. 51 . Apoptoz gelişimi: apoptozu açmak için iki mekanizma gösterilmiştir - mitokondriyal geçirgenlikteki ("varsayılan olarak apoptoz") ve reseptördeki ("aktivasyon") artıştan kaynaklanır. Her iki mekanizma da apoptozun tek bir efektör mekanizmaya göre gerçekleşmesine yol açmaktadır. TRAIL, tümör nekroz faktörüne bağlı apoptozu indükleyen bir liganddır; FasL - РсFas için ligand (Fas ligandından); TNFRI - Tümör nekroz faktörü I için RC (TNF reseptörü I'den); DR - "ölüm" RC'si (- Ölüm alıcısından); FADD - RC Fas'ın "ölüm" alanı (Fas ile ilişkili ölüm alanından); TRADD - tümör nekroz faktörü için RC'nin "ölüm" alanı (TNF reseptörü ile ilişkili ölüm alanından). Faktörleri simgeleyen simgelerin yanında isimleri belirtilmektedir. Düz oklar dönüşümleri, noktalı oklar etkileri, kesikli oklar faktörlerin hareketlerini ifade eder. Metindeki açıklamalar.

Pek çok hücre (belki de çoğu) canlılıklarını sürdürmek için özel sinyallere ihtiyaç duyar. Bu tür hayatta kalma sinyallerinin kaynağı genellikle sitokinler ve çevredeki hücrelerle temas etkileşimleridir. Hücrede hayatta kalma sinyallerinin yokluğunda mitokondriyal fonksiyon, özellikle glikoliz ve ATP defosforilasyon mekanizmaları bozulur. ADP ve glikolitik ürün piruvat, oksidatif fosforilasyonun, elektron taşınmasının ve proton gradyanının oluşturulmasının normal uygulanması için gerekli olduğundan, bu işlemler bozulur ve mitokondriyal membranın hasar görmesine neden olur.

Buna paralel olarak, Bc1-2 ailesinin proto-onkogenlerinin ürünleri olan proteinler tarafından gerçekleştirilen bir mekanizma tetiklenir. Bu proteinler birkaç gruba ayrılır. Bazı proteinler 3-4 BH alanı içerir (BH - Bcl-2 homolojisinden) ve anti-apoptotik (Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, vb.) ve pro-apoptotik (Bax, Bak, , Bcl–X S, vb.) faktörler. Özel bir grup, ismine uygun olarak yalnızca bir BH alanı - BH3 içeren "yalnızca BH3" proteinlerinden ("yalnızca BH3" - Bad, Bid, Bik, Bim, Noxa, Bbc3, vb.) oluşur, ve diğer açılardan söz konusu ailenin proteinlerinden farklıdırlar. Apoptoz için varsayılan tetikleyici faktörlerin rolü atananlar, hücre iskeletinden mobilize edilen, öncelikle Bim olmak üzere "yalnızca BH3" proteinleridir. "Yalnızca BH3" proteinlerinin ekspresyonu veya aktivasyonu, sitokinlerin ve diğer hayatta kalma faktörlerinin eksikliği koşulları altında ve ayrıca DNA kırılmalarının sensörü olan p53 proteininin aktivasyonu sırasında meydana gelir (ikinci durumda, "yalnızca BH3") Noxa ve Bbc3 faktörleri etkinleştirilir). "Yalnızca BH3" proteinleri, Bcl-2 gibi anti-apoptotik faktörleri bloke ederek onlarla dimerler oluşturur ve pro-apoptotik faktörlerin aktivitesinin ortaya çıkmasını destekler. İkincisinin aktivitesinin ana tezahürü, normalde anti-apoptotik faktörler tarafından baskılanan Bax ve Bac'ın oligomerizasyonunun bir sonucu olarak oluşan zar ötesi gözeneklerin oluşumudur.

Mitokondriyal membrandaki gözeneklerden sitokrom C ve APAF-1 (Apoptoz proteaz aktivasyon faktörü 1) sitozole girer. APAF-1, mitokondriyal membrandan salınır: Bik faktörü onu, membranda tutulduğu Bc1-2 veya BCL-XL faktörleriyle birlikte heterodimerden uzaklaştırır. APAF-1 ve sitokrom C, ATP varlığında, aktif olmayan bir kaspaz olan prokaspaz 9 ile bir kompleks oluşturur. Bu komplekse apoptozom adı verilir. İçinde procaspase'deki homolog alanı tanıyan APAF-1'in etkisi altında kaspaz aktivasyonu meydana gelir 9. Reseptör mekanizmasının aksine, apoptozun mitokondriyal yolunun uygulanması, bir dizi genin ekspresyonunu ve sentezini gerektirir. yeni RNA ve protein.

Kaspaz aktivasyonundan önce apoptoz süreci geri dönüşümlüdür. Apoptotik sinyalin yara yolları boyunca yayılmasının engellenmesi farklı şekillerde meydana gelir. Apoptozun reseptör mekanizması, kaspaz 8'in karakteristik efektör ölüm alanlarını içeren, ancak katalitik merkezi olmayan bir grup FLIP faktörünün (FLICE-inhibitör proteinler; FLICE - kaspaz 8'in eski adı) aktivasyonu nedeniyle kesintiye uğrayabilir. . Sonuç olarak, bu kaspazın eylemini rekabetçi bir şekilde bloke ederler. Apoptozun mitokondriyal aktivasyon mekanizması, Bc1-2 ailesinin yukarıda belirtilen anti-apoptotik faktörleri, öncelikle Bc1-2'nin kendisi ve Bcl-X L tarafından bloke edilir. Bc1-2'nin etkisi esas olarak "yalnızca BH3" faktörlerini bağlama ve bunların Bax-Bak komplekslerinin oluşumu üzerindeki uyarıcı etkisini önleme yeteneği ile ilişkilidir. Bcl-2 ayrıca Apaf-1'in yanı sıra Bax ve Bak'a da doğrudan bağlanabilmektedir. Bu mekanizmalar mitokondride transmembran gözeneklerinin oluşumunu ve/veya apoptozom oluşumunu engeller. Ayrıca, proapoptotik faktörün seramide ait olduğu sfingomiyelin metabolitleri tarafından gerçekleştirilen proliferasyon ve apoptoz dengesini kontrol eden bir mekanizma olan "sfingomiyelin reostatından" da bahsetmek gerekir.

Yani apoptozun her iki yolu da kaspazların aktivasyonuna yol açar. Kaspazlar, aspartik asit kalıntılarından sonra polipeptit bağını parçalayan bir grup sistein proteazdır. Bireysel kaspazlar arasındaki spesifiklik farkı, NH2 ucuyla kırılma bölgesine bitişik çeşitli tetrapeptitlerin tanınmasına iner. Reseptör yolu kaspaz 8'in aktivasyonuna yol açar (daha az yaygın olarak kaspaz 2 ve 10), mitokondriyal yol kaspaz 9'un aktivasyonuna yol açar. Bu enzimler başlatıcı kaspazlar grubuna aittir. Aktif olmayan formlarında (prokaspazlar), iki proteaz alanıyla birlikte, FADD ve diğer adaptör proteinleri ile etkileşim için iki ölüm alanı (prokaspaz 8 ve 10) veya prokaspazı apoptozom içine alan bir alan (prokaspaz 9 ve 2) içerirler. Bunların aktivasyonu, adaptör proteinleri (FADD, Apaf-1) ile etkileşimin bir sonucu olarak ortaya çıkan ve uzun N-terminal bölgesinin otokatalitik bölünmesine neden olan agregasyonun bir sonucudur. Molekülün aktivasyonu sırasında alanlar yeniden düzenlenir ve aktif bir heterodimer oluşur (kaspaz 8 durumunda p18/p11-p18/p11 tetramer, kaspaz 9 durumunda trimer). Başlatıcı kaspazların aktivasyonundan sonra apoptoz süreci geri döndürülemez hale gelir.

Başlatıcı kaspazlar kısmi proteolize (kısa bir pro-domain'in bölünmesi) ve bunun sonucunda yürütücü veya efektör kaspazlar 3, 6 ve 7'nin aktivasyonuna neden olur. Apoptozda katılımında en önemli ve evrensel olanı kaspaz 3'tür. Aktif kaspaz 3 bir p17/p12 dimeridir. Yönetici kaspazlar aynı zamanda öldürücü lenfositlerden (T ve NK) hedef hücrelere taşınan bir serin proteaz olan granzim B'nin etkisi altında da oluşturulur.

Yönetici kaspazların hedefi, önemli bir kısmı çekirdekte lokalize olan çok sayıda proteindir. Hedef moleküllerin bölünmesi apoptozun tüm belirtilerini belirler. Kaspaz 3'ün ana hedeflerinden biri olan endonükleaz CAD (Kaspazla aktifleştirilen DNaz), inhibitör alt bileşenin bölünmesi sonucu aktive olur. Aktive edilmiş CAD, nükleozomlar arasında yer alan molekülün erişilebilir bölgelerine etki ederek DNA'yı bozar. Nükleer enzimler PARP (Poli-ADP-Riboz Polimeraz) ve DNA'ya bağımlı protein kinazın aynı kaspaz tarafından bölünmesi, DNA onarım sürecini bloke eder. Kaspazların retinoblastoma faktörü (Rb) ve protein kinaz C'nin d-izoformu üzerindeki etkisi, hücre döngüsü kontrolünün bozulmasını belirler. MNK-1 ve FAK kinazların bölünmesi, hücre yapışmasının zayıflamasıyla sonuçlanan değişikliklere yol açar ve gelsolin ve PAK kinazın bölünmesi, hücre morfolojisindeki karakteristik değişiklikleri belirler.

Apoptoz geçiren hücrelerin hızlı bir şekilde fagositoza uğradığından daha önce bahsedilmişti. Bu, fagositler tarafından tanınan ve fagositoz sürecini kolaylaştıran bir dizi molekülün apoptotik hücrelerin yüzeyinde ekspresyonuyla kolaylaştırılır. Böylece apoptoz sırasında membranın asimetrisi bozulur ve normalde membranın iç yüzeyinde lokalize olan fosfatidilserin yüzeyde açığa çıkar. Makrofaj CD14 molekülü ve muhtemelen diğer RC'ler tarafından tanınır. Membran glikokonjugatlarının desialilasyonu sonucu oluşan serbest şeker kalıntıları, fagositlerin membran lektinleri tarafından tanınır. Apoptotik hücrelerin yüzeyinde de görünen trombospondin, sinyallerin fagositik hücre içinde iletildiği ve metabolizmasını aktive ettiği adezyon molekülleri - integrin a 2b2 ve CD36 tarafından tanınır. Lizozomal DNaz II, fagosit içinde zaten bulunan apoptotik hücrenin DNA bozunmasını tamamlar. Hızlı fagositoz ve hücre içi içeriğin hücreler arası boşluğa salınmaması nedeniyle, ölmekte olan hücre onu "kirletmez" ve apoptoz ile nekroz arasındaki önemli bir fark olan ölüm sürecine komşu hücreleri dahil etmez.

Apoptotik hücrelerin yoğun fagositozu nedeniyle bunların tanımlanması zordur. yerinde. Apoptoz sürecinin tanımlanması hücrelerdeki morfolojik değişikliklerin kaydedilmesiyle sınırlı değildir (bu çok subjektif bir göstergedir). Yukarıda tartışılan bir takım süreç özelliklerine dayanmaktadır (Şekil 52). Apoptozun belirlenmesine yönelik yöntemlerin çoğu, DNA bozulmasının tespit edilmesine dayanmaktadır. Yakın zamana kadar, hücreden ekstrakte edilen DNA parçalarının elektroforezi, hücre apoptozunu belirlemek için ana ve en güvenilir yöntem olarak kullanıldı: apoptoz, bir "merdiven", yani DNA uzunluğunun katları olan parçaların varlığı ile karakterize edilir. elektroforez sırasında ayrı fraksiyonlar şeklinde görünen nükleozomda. Onarılmamış DNA kırılmalarını tanımlamak için, etiketli nükleotidlerin DNA zincirinin serbest 3" ucuna terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) katalizli bağlanmasına dayanan TUNEL yöntemi (TdT aracılı dUTR-biotin Nick End Etiketleme) kullanılır ve ardından bu yöntem kullanılır. etiketli hücrelerin immünohistokimyasal veya sitoflorometrik yöntemlerle tespiti.Bir tarama yöntemi olarak, propidyum iyodür boyama kullanılarak hipodiploid hücrelerin (yani bozunması nedeniyle DNA'nın bir kısmını kaybetmiş hücreler) sitoflorometrik tespiti kullanılır... Yaygın olarak kullanılan başka bir sitoflorometrik yöntem apoptozu belirlemek için, ekleri bağlama yeteneğine sahip olan hücreler tarafından fosfatidilserin ekspresyonunu tespit etmek için kullanılır Florokrom etiketli V. Anneksin ve propidyum iyodür boyamanın birleştirilmesi, apoptotik ve nekrotik hücrelerin farklılaşmasına izin verir (yalnızca ikincisi, önceden sabitleme olmadan propidyum ile boyanır) ).

Pirinç. 52 . Apoptozu belirleme yöntemleri. a - apoptoz sırasında DNA bozulmasının çeşitli belirtilerini gösteren oligonükleotidlerin elektroferogramlarının diyagramları (solda - ayrı fraksiyonların oluşumu ile internükleozomal DNA bozulmasının sonuçlarını yansıtan bir “merdiven”) ve nekroz (sağda - katı bir nokta) , düzensiz DNA bozulmasını yansıtır), b - propidium iyodür ile DNA için boyanmış sabit hücrelerin sitoflorometrik analizinden elde edilen bir histogram. Ana tepe diploid hücrelere karşılık gelir, sağdaki tepe hücre döngüsündeki hücrelerdir, soldaki tepe M1 imleci ile işaretlenmiştir - apoptoz sonucunda DNA'larının bir kısmını kaybetmiş hipodiploid hücreler - %28,7 toplam, c - sabitlenmemiş hücrelerin sitoflorometrik analizinin sonuçları, anneksin V'nin floresan izotiyosiyanat (apsis ekseni boyunca) ve propidyum iyodür (ordinat ekseni boyunca) ile lekeli konjugatı. Canlı hücreler sol alt kadranda bulunur. Sağ alt kadran apoptoza uğramış hücreleri içerir (ek V'e bağlanır, ancak propidyum iyodüre karşı geçirimsizdir), sol üst kadran nekroz geçirmiş hücreleri içerir (propidyum iyodüre karşı geçirimsiz, ek V'e bağlanmaz), sağ üst kadran Hücrelerin apoptoz geçirerek nekroza dönüştüğüne inanılıyor.

1) Reseptör. Çoğu tümör nekroz faktörü süper ailesine ait olan ilgili ligandlarla etkileşimi aktive ederek "ölüm reseptörleri" kullanılarak gerçekleştirilir. Reseptörün ligand ile etkileşimi, "ölüm alanları" (FADD - Fas ile ilişkili ölüm alanı, TRADD - TNF-R ile ilişkili ölüm alanı) ve prokaspaz 8 ile ilişkili adaptör proteinlerinin aktivasyonuna yol açar; kaspaz 8 (başlatıcı), kaspaz 3'ü (efektör) aktive eder ve bu da DNA'yı parçalayan endonükleazların aktivasyonuna neden olur.

2) Mitokondriyal. Mitokondrinin apoptoza katılımı, matrikslerinde ve zarlar arası boşluklarında çok sayıda biyolojik olarak aktif maddenin (sitokrom C (Cyt C); prokaspazlar 2, 3, 9; apoptoz indükleyici faktör (AIF) bulunmasıyla sağlanır. belirgin bir apoptojenik etki Apoptoz için aktivasyon faktörü, dev mitokondriyal gözeneklerin açılması nedeniyle (Ca2 + -, pH -, potansiyel rolünü oynayan) mitokondrinin transmembran potansiyelinde bir azalma ile bu maddelerin sitoplazmaya salınmasıdır. -, NADP2H/NADP + - ve redoks bağımlı kanallar) ve mitokondriyal membranların geçirgenliğinde artış. Gözeneklerin açılması, hücrelerdeki indirgenmiş glutatyonun, NADPH, ATP ve ADP'nin tükenmesi, reaktif oksijen türlerinin oluşumundan kaynaklanır. , oksidatif fosforilasyonun ayrılması, sitoplazmada Ca2 + içeriğinin artması, zarlar arası proteinlerin girişi ve apoptozun aktivasyonu, iç zarın hiperpolarizasyonu nedeniyle dış mitokondri zarı yırtıldığında da mümkündür.

3) p53 aracılı. p53, hücrenin durumu, genomunun bütünlüğü ve DNA onarım sistemlerinin aktivitesi hakkındaki sinyallerin izlenmesinde önemli rol oynayan çok işlevli bir proteindir. DNA hasarı hücrede p53 proteininin birikmesine yol açar. Bu, G1 ve G2 fazlarında hücre döngüsünün durdurulmasını belirler, replikasyonu önler, DNA sentezini ve onarımını aktive eder ve bu nedenle doğal DNA yapısının restorasyonu için koşullar yaratır ve vücutta mutant ve anöploid hücrelerin ortaya çıkmasını önler. DNA onarım sistemlerinin yetersizliği ve DNA hasarının devam etmesi durumunda hücre apoptoza uğrar. Özellikle p53 proteini, Bax, Fas reseptörü, DR-5 vb. gibi apoptojenik faktörlerin transkripsiyonunu indükleme kapasitesine sahiptir.

4) Performans granzimi. Sitotoksik T lenfositleri (öldürücü T hücreleri), performans proteinini kullanarak hedef hücrelerin (örn. enfekte hücreler) apoptozunu indükler. Polimerleşen perforin, hedef hücrenin sitoplazmik zarında transmembran kanalları oluşturur; bu kanallardan T-öldürücü tarafından salgılanan granzimler (fragmentinler) - serin proteazların bir karışımı - hücreye girer. Bu karışımın ana bileşeni kaspaz 3'ü aktive eden proteolitik bir enzim olan granzim B'dir.

Apoptozun protein düzenleyicilerinin vücudun gelişiminde ve patolojik süreçlerde önemi

Bcl-2 Embriyonik gelişim sırasında lenfositlerin, melanositlerin, bağırsak epitelinin ve böbrek hücrelerinin canlılığını korumak için gereklidir.

Вcl-x Embriyogenezde, özellikle sinir sisteminde hücre ölümünün engellenmesi için gereklidir.

Bax Timositlerin apoptozu ve gelişimleri sırasında sperm canlılığının sürdürülmesi için gereklidir.

s.53 tümör baskılayıcı bir gendir, bu nedenle embriyogenezde özel bir rol oynamaz ancak tümör büyümesinin baskılanması için kesinlikle gereklidir.

Bcl-2 geni tarafından kodlanan proteinin artan sentezi, apoptozun baskılanmasına ve buna bağlı olarak tümörlerin gelişmesine yol açar; bu fenomen B hücreli foliküler lenfoma hücrelerinde bulundu.

Farelerde lenfoproliferatif hastalıklarda ve sistemik lupus eritematozus benzeri hastalıkta Fas ligandı veya Fas reseptör fonksiyonu bozulmaktadır.

Artan sentez Fas ligandı transplant reddini önler.

Apoptoz, hücrelerin adenovirüsler, baculovirüsler, HIV ve influenza virüsleri ile enfekte olduğu patolojik sürecin bir parçasıdır.

Konakçı hücrede apoptozun inhibisyonu, kalıcı enfeksiyon sırasında, latent dönemde gözlenir ve adenovirüsler, bakulovirüsler, muhtemelen herpesvirüsler, Epstein-Barr virüsü ve HIV'in çoğalmasının artmasıyla birlikte, bağışıklık sistemi hücrelerinde apoptozun aktivasyonu gözlenir. virüsün yayılmasına katkıda bulunuyor.

Okumak faydalı olabilir: