Apoptoza. Opredelitev

1007 0

Glavna naloga sistema za uravnavanje apoptoze je- ohranijo efektorske kaspaze, ki razgrajujejo celice, v neaktivnem stanju, vendar jih hitro pretvorijo v aktivno obliko kot odziv na minimalno delovanje ustreznih induktorjev.

Funkcijo aktivacije efektorskih kaspaz prevzamejo induktorske kaspaze, katerih glavni predstavnici sta kaspaza 8 in kaspaza 9.

Te kaspaze so v normalnem stanju celice neaktivne in obstajajo v obliki prokaspaz. Zato je delovanje različnih proapoptotičnih signalov usmerjeno v aktiviranje kaspaze 8 in kaspaze 9.

V skladu s tem obstajata dve vrsti vodilnih signalnih poti:

1) Poškodba DNA, sevanje, delovanje toksičnih snovi, delovanje glukokortikoidov, prenehanje regulacije citokinov, skrajšanje telomer na kritično raven - aktivacija kaspaze 9;
2) Proapoptotični signali, ki izhajajo iz aktivacije receptorjev "regije celične smrti" (na primer Fas-R, TNF-R) - aktivacija kaspaze 8.

Zaporedoma razmislimo o vsaki od teh poti, shematično predstavljenih na sl. 1.4.

Signalne poti za aktivacijo kaspaze 9

Gen P53 je senzor poškodb DNK in motenj v celičnem ciklusu.

P53 gen

Gen P53, ki se nahaja na kratkem kraku 17. kromosoma, kodira tvorbo jedrnega proteina, sestavljenega iz 393 aminokislin z molekulsko maso 53 Kd. Tetramer P53 deluje kot transkripcijski faktor, ki se s svojim karboksilnim koncem veže na specifične regije ciljnih genov. Protein P53 je v citoplazmi v latentnem stanju.

V zadnjih letih se je izkazalo, da do njegove aktivacije ne pride le kot odgovor na poškodbo DNK, ampak je lahko tudi posledica mnogih drugih procesov, ki se dogajajo v celici, vključno z aktivacijo onkogenov, hipoksijo, prehransko pomanjkljivostjo, staranjem in drugimi. Ni zaman, da so ta gen nekateri avtorji imenovali "gospod nočni čuvaj", drugi pa "varuh genoma".

Ko je P53 aktiviran, lahko protein sproži 2 programa neodvisno drug od drugega:

  • Začasna zaustavitev celičnega cikla v fazi G1/S z uporabo proteina p21 WAF1, ki zavira od ciklina odvisne kinaze
  • Stimulacija apoptoze z aktiviranjem gena Bax - pro-apoptotičnega gena iz družine Bcl-2 in/ali aktiviranjem tvorbe prostih oblik kisika, ki pospešuje sproščanje citokroma-C iz mitohondrijev.
Eksperimentalni podatki o zaustavitvi genov, ki so se pojavili v zadnjih letih, kažejo, da je prednostni program za večino celic začasna ustavitev mitotičnega cikla. Obstajajo tudi informacije o sodelovanju P53 v procesih popravljanja DNA z aktivacijo na novo odkritega gena P53R2, ki kodira ribonukleotidno reduktazo. Program apoptoze se aktivira, ko celica ne more popraviti DNA med "zaustavitvijo" med mitotskim ciklom in/ali pomanjkanjem proteina p21 WAF1. Pri nekaterih celicah je prioriteta programa apoptoze ob aktivaciji gena P53 genetsko določena.

Vloga P53 je odvisna od tkiva. Pri miših v poskusu z izklopom tega gena obsevanje ni povzročilo apoptoze v limfocitih, v pljučnem tkivu pa so bili znaki apoptoze jasno izraženi.

Slika 1.4. Glavne poti apoptoze. Wah, Bid - družina proapoptotičnih genovVсl-2. dATP - adenozin trifosforna kislina. APAF-1 - faktor aktivacije apoptotične proteaze

Na sliki so prikazane glavne poti apoptoze, ki izvajajo pro-apoptotične signale dveh glavnih vrst: poškodbe DNK s sevanjem ali citotoksičnimi sredstvi) in aktivacijo receptorjev "regije celične smrti".

Poškodba DNK povzroči aktivacijo gena P53. Nadaljnji prehod te vrste apoptotičnega signala poteka z aktivacijo proapoptotičnih genov družine Bcl-2 (Bax in Bid). Proteini teh genov povzročajo permeabilizacijo mitohondrijske membrane in sproščanje citokroma C v citosol, adenozin trifosforna kislina (dATP), faktor indukcije apoptoze (Aif) in DNaza. Citokrom C skupaj z dATP aktivira protein APAF-1, ki se nahaja v citosolu in tvori apoptosom, v katerem se aktivira kaspaza-9. Slednja aktivira kaspazo-3, glavno »izvršilko« kaspazne kaskade.

Po tem se aktivirajo druge kaspaze, proteaze in DNaze in pride do apoptoze. Aif in DNaza, sproščena iz mitohondrijev, izvajata dodatno ekstrakaspazno pot apoptoze in svojo aktivnost izvajata neposredno v jedru.

Vezava receptorjev "regije celične smrti" z ustreznimi ligandi vodi do aktivacije kaspaze 8, ki je sposobna neodvisne aktivacije kaspaze 3. Na tej poti lahko pride do dodatne vpletenosti genske družine Bcl-2 preko aktivacije Bid genske beljakovine s kaspazo 8.

In vendar je treba glavno funkcijo gena P53 šteti za aktivacijo programa apoptoze, ko je celični genom poškodovan, kar lahko obravnavamo kot zaščitno reakcijo telesa pred kopičenjem genetsko okvarjenih celic. Zmanjšanje aktivnosti gena P53 ali mutacija v njem, ki vodi do izgube sposobnosti iniciacije apoptoze, je resen dejavnik, ki povzroča nagnjenost k nastanku tumorjev in razvoju odpornosti na kemoterapijo.

Mutacijo gena P53 najdemo pri več kot polovici rakavih obolenj, njena pogostnost pa se poveča z dolgotrajno kemoterapijo. Pri otrocih je mutacija gena P53 pogostejša pri T-ALL, kar predstavlja približno 12% in je vedno neugoden prognostični dejavnik.

Torej, gen P53 je potreben za izvajanje programa apoptoze v primeru poškodbe DNA in toksičnih učinkov na celico. Kot je razvidno iz diagrama (slika 4), je naslednji korak pri izvajanju proapoptotičnega signala po tej poti vključitev družine genov Bcl-2.

Družina genov Bcl-2

Zanimanje za apoptozo se je močno povečalo sredi 80. let, ko so odkrili, da povečana aktivnost onkogena Bcl-2, ki je posledica translokacije t(14;18), ki je pogosta pri človeških B-celičnih folikularnih limfomih, vodi do nastanek tumorskega klona ne zaradi povečane proliferacije, temveč zaradi povečanega preživetja tumorskih celic.

Kasneje je bilo dokazano, da se med to translokacijo onkogen Bcl-2, prvotno lociran na kromosomskem segmentu 18q21, spoji z lokusom, ki kodira težko verigo Ig na kromosomu 14q32, kar vodi do njegovega povečanega izražanja. Molekularne genetske študije v naslednjem desetletju so pokazale, da tako imenovana družina genov Bcl-2, preslikanih na kromosom 18 pri ljudeh, vključuje tudi druge gene, ki izražajo proteine ​​z nasprotno funkcijo (glej tabelo 1.1).

Tabela 1.1. Sestava družineVсl-2geni

* označuje število ohranjenih sekvenc, znanih kot Bcl-2 homologne regije. **** - 4 regije (VN1-VN4); *** - 3 regije (VN1-VNZ); ** - 2 regiji (VNZ, VN4); * - 1 regija (VNZ); COOH-terminalna hidrofobna domena, odgovorna za pritrditev proteinov na zunanjo lamino mitohondrijske membrane.

Trenutno je kloniranih 16 genov, ki sestavljajo to družino. Proteini, pridobljeni iz teh genov, imajo podobno morfološko sestavo – vsak od njih ima vsaj eno od 4 ohranjenih aminokislinskih sekvenc, značilnih za gen Bcl-2. Te sekvence so znane kot regije, homologne Bcl-2 (BH1-BH4). Funkcionalni pomen teh regij ni povsem jasen, vendar po mnenju nekaterih raziskovalcev zagotavljajo reaktivne sposobnosti proteinov te družine.

Kot izhaja iz prikazanih v tabeli 1.1. podatkov, le 6 jih je, tako kot ustanovitelj te družine - Gen Bcl-2, anti-apoptotični učinek: ščiti celice pred širokim spektrom fizioloških in eksperimentalnih vplivov, katerih cilj je indukcija apoptoze. Takšni dražljaji vključujejo poškodbe DNA, delovanje glukokortikoidov, prenehanje regulacije citokinov itd. Nekateri proteini v tej skupini imajo COOH-terminalno hidrofobno regijo, ki je odgovorna za pritrditev beljakovin na zunanjo površino mitohondrijske membrane.

Preostalih 10 članov družine Bcl-2 povzroča apoptozo. Te proapoptotične proteine ​​lahko razdelimo v 2 podskupini, odvisno od števila regij VL, ki jih imajo. Prvi 4 (glej tabelo 1.1.) imajo 2-3 VN regije, preostalih 6 pa le eno VZ regijo. S to regijo je povezana proapoptotična funkcija proteinov. Številni proapoptotični proteini, tako kot antiapoptotični proteini te družine, imajo končno hidrofobno domeno, vendar se za razliko od slednjih ne pritrdijo na mitohondrije, preden prejmejo proapoptotični signal.

Zaznavanje anti- ali proapoptotičnih signalov s strani članov družine Bcl-2 poteka tako na genski ravni (na primer protein P53 poveča izražanje gena Bax) kot na ravni post-transkripcijskih proteinov (delovanje citokini). Hkrati opazimo kompleksne interakcije med samimi proteini, včasih na antagonističen način. Med temi interakcijami lahko pro- in anti-apoptotični proteini tvorijo homo- in heterodimere znotraj lastne skupine in z beljakovinami nasprotne smeri delovanja (glej sliko 1.5). Nekatere povezave med promotorji in zaviralci celične smrti so zelo specifične (na primer Bok in Mc1-1), druge so precej naključne.

Slika 1.5. Načini interakcije med družinskimi proteiniVсl-2

Pomen teh interakcij je bil doslej razjasnjen le v zvezi s proapoptotičnimi proteini, ki imajo eno domeno B3. Ti proteini lahko realizirajo svojo proapoptotično aktivnost le na antagonističen način, pri čemer tvorijo heterodimere z antiapoptotičnimi proteini družine Bcl-2. To pravilo ne velja za vse družinske člane; Bcl-xL, na primer, ne potrebuje vezave na promotor celične smrti, da bi izrazil svojo antiapoptotično aktivnost.

Slika 1.6. Nagnjenost k apoptozi. Razmerje med številom homodimerov in heterodimerov določa dovzetnost za apoptozo

Kot rezultat številnih dosedanjih poskusov se zdi, da se odločitev o življenju ali smrti za celico sprejme na ravni družine Bcl-2 na podlagi relativne prevlade aktivnih zaviralcev ali spodbujevalcev apoptoze. To stanje je shematično prikazano na sl. 1.6.

Kako se ta odločitev izvaja, kaj je potrebno za nadaljnji napredek po signalni poti, katere končna točka naj bi bila aktivacija induktorske kaspaze 9?

Pro- in anti-apoptotični učinki aktiviranih proteinov družine Bcl-2 se uresničujejo predvsem z modulacijo mitohondrijske aktivnosti.

Vloga mitohondrijev v procesih apoptotične celične smrti

Mitohondrije- matriks, ki ga tvorijo celični organeli in je obdan z dvoslojno membrano. Mitohondrij vsebuje genom, ki lahko kodira omejeno število RNA in proteinov, potrebnih za njegovo delovanje, vendar je večina komponent mitohondrija kodiranih v jedru in nato uvoženih vanj. Vloga mitohondrijev pri ohranjanju življenja je velika - so glavni vir celične energije, ki tvorijo ATP iz ADP z oksidativno fosforilacijo. Hkrati mnogi raziskovalci menijo, da so mitohondrije ključni akterji apoptoze.

To je posledica dejstva, da so mitohondriji vir citokroma C, ATP, Ca++, AIF (faktor indukcije apoptoze)- komponente, potrebne za nadaljnje spodbujanje apoptotičnega signala. Do sproščanja teh dejavnikov iz mitohondrije pride šele, ko njegova membrana sodeluje z aktiviranimi proteini družine Bcl-2. Veliko v tem procesu zahteva pojasnilo, vendar ga lahko shematično predstavimo na naslednji način. Aktivirani proteini družine Bcl-2 so kot sidra pritrjeni na zunanjo membrano mitohondrijev s svojimi COOH – hidrofobnimi bazami.

To se zgodi na mestih, kjer se združita zunanja in notranja membrana, kjer očitno fiziološko obstajajo permeabilizacijske pore, imenovane megakanali, s premerom, ki ne presega 2 nm. Te pore delujejo kot senzorji za številne fiziološke parametre in tako posredujejo informacije o glavnih presnovnih procesih, ki potekajo v celici. So kanali za Ca2+, napetost, pH, aktivne oblike O2, vendar ne prepuščajo nekaterih anionov skozi in so neprehodni za večje molekule citokroma C, ATP in Aif, ki so potrebni za apoptozo.

Pokazalo se je, da se proapoptotični proteini iz družine Bcl-2 (Bax, Bad, Bak itd.), ukoreninjeni v zunanji membrani, združijo z ANT (adenin-nukleotid-translokator), vgrajenimi v notranjo membrano na teh lokusih, in tvorijo začasno več velikih megakanalov (premera 2,4-3 nm). Skozi te kanale citokrom C, ATP in faktor, ki inducira apoptozo, vstopajo v celični citosol. Antiapoptotični proteini družine Bcl-2 ne morejo permeabilizirati mitohondrijske membrane, ampak po nekaterih podatkih nasprotno zaprejo obstoječe kanale in tako prekinejo napredovanje proapoptotičnega signala in zaščitijo celico pred apoptozo. . Kakšen je namen proapoptotičnih mitohondrijskih signalnih molekul?

Citokrom-C- protein z molekulsko maso 15 kDa, kodiran z jedrnim genomom, sintetiziran kot apocitokrom C, uvožen v mitohondrije, kjer se pritrdi na notranjo površino membrane in izstopi v citosol skozi megakanale, ki mu jih odprejo proapoptotični proteini. družine Bcl-2 (Bax, Bad, Bak itd.). Citokrom-C je potreben za nastanek apoptosoma, kjer se aktivira kaspaza 9, ta pa nato aktivira glavno »morilsko« kaspazo 3 (glej sliko 1.4). S tem se konča apoptotična signalna pot, ki jo povzroči poškodba DNK.

Apoptosom je kompleks APAF-1 (faktor aktivacije apoptotične proteaze), citokroma-C, kaspaze-9 in ATP. Preden se združi s citokromom C, obstaja APAF-1 v citosolu v neaktivnem stanju. V odsotnosti zadostne količine ATP ne pride do tvorbe apoptosoma in celična smrt sledi nekrotični poti.

Skupaj s citokromom-C in ATP iz mitohondrijev v celični citosol izstopa tudi AIF (faktor, ki povzroča apoptozo). Sintezo tega faktorja kodira tudi jedrski genom, transformacija v zrelo obliko (protein z molekulsko maso 75 kDa) se pojavi v mitohondrijih. Po izstopu iz mitohondrija AIF potuje v celično jedro, kjer povzroči fragmentacijo DNA, ki spominja na apoptozo. Prekomerna ekspresija Bcl-2 prepreči sproščanje faktorja, ki inducira apoptozo, iz mitohondrijev, ne pa tudi njegove aktivnosti, ko se AIF vnese v celico v poskusu. AIF ne potrebuje citosolne aktivacije, sprosti se iz mitohondrija v citokrom-C in po možnosti prispeva k njegovemu sproščanju. Tako je faktor, ki inducira apoptozo, neodvisen "ubijalski" faktor, ki podvaja delovanje citokroma-C in kaspaz, ko so blokirani.

Zanimivo je, da med procesom apoptoze mitohondriji ne izgubijo svoje celovitosti in se ne uničijo.

Tukaj našteti dogodki tvorijo osnovo hipoteze, da se zdi, da je mitohondrij ključni igralec pri apoptozi. Vendar pa obstaja alternativna hipoteza, ki meni, da je kaskadna aktivacija kaspaz glavni motor apoptoze, medtem ko citokrom C, sproščen iz mitohondrijev, ni iniciator, ampak le ojačevalec apoptotične kaskade. Zadnje ideje so podprte s podatki, da je aktivnost družine Bcl-2 mogoče podpirati brez sodelovanja mitohondrijev. Pokazalo se je, da lahko anti-apoptotični proteini te družine tvorijo kompleks z APAF-1 v citosolu in blokirajo njegovo aktivnost. Zaviranje te povezave s proapoptotičnimi člani družine Bcl-2 sprosti APAF-1 in mu omogoči aktiviranje kaspaze 9.

Signalna pot aktivacije kaspaze 8

Prenos proapoptotičnega signala, ko se ligand veže na receptorje regije celične smrti, poteka prek adapterskih proteinov FADD/MORT1, katerih N-terminalna regija (DED) se nato veže na podobno regijo prokaspaze-8, kar povzroči njegovo avtokatalitično aktivacijo (glej sliko 1.4 in sliko 1.7). Ko se aktivirajo nekateri člani družine receptorjev TNF (vključno s TNF-R1), se uporabi dodatni adapterski protein, TRADD.

Slika 1.7. Apoptoza, povzročena s signalom območja celične smrti. Domena smrti, povezana s FADD-fas (regija celične smrti, povezana s FAS); Domena smrti, povezana s TRADD-TNF (regija celične smrti, povezana s cTNF-R); DD - domena smrti (regija smrti); DED - Death effector domena (regija izvršitelja smrti); NF-kB, AP-1 - transkripcijski faktorji, ki aktivirajo provnetne in imunomodulatorne gene

Zdi se, da je receptorska pot celične smrti krajša od apoptotične kaskade, ki jo sproži poškodba DNA in je obravnavana zgoraj: kaspaza 8 se aktivira prek adapterskih molekul, ki lahko nato neposredno aktivirajo krvne kaspaze. A to je le osnovna shema, v resnici je ta signalna pot veliko bolj kompleksna in prepletena z drugimi mehanizmi apoptoze. Tako je znano, da je kaspaza 8 sposobna aktivirati protein Bid, kar vodi, kot je podrobno opisano zgoraj, do sproščanja citokroma C iz mitohondrijev. Čeprav je jasno, da ta pot ne zahteva aktivacije mitohondrijev, njihova vpletenost v proces poveča receptorsko inducirano apoptozo (glej sliko 1.4).

Ista signalna pot z vključitvijo drugih adapterskih proteinov se uporablja tudi za izvajanje drugih celičnih programov. Tako lahko signal, ki prehaja skozi TNF-R1, aktivira tudi transkripcijska faktorja NF-kB in AP-1. Te signalne molekule povzročijo aktivacijo genov, ki proizvajajo vnetne dejavnike. Tako se mora celica, ko se aktivira TNF-R, odločiti, ali naj naredi samomor ali preživi, ​​da proizvede vnetne citokine.

Slednjo odločitev pogosteje sprejmejo limfociti, verjetno zato, ker transkripcijski faktor NF-kB zavira apoptotične poti. Na izbiro celice očitno vpliva tudi celična skupnost. Ta primer potrjuje, da se iste signalne poti uporabljajo za izvajanje različnih celičnih programov; mehanizmi izbire in odločanja ostajajo večinoma nejasni. Tako je receptorska pot celične smrti v limfocitih neodvisna od družine genov Bcl-2 in je ni mogoče zatreti z njihovo antiapoptotično aktivnostjo.

Aktivacija P53 lahko v nekaterih celičnih sistemih vodi do transaktivacije genov, ki kodirajo receptorje regije "celične smrti".

Tako obstajajo različne, pogosto prekrivajoče se poti in mehanizmi za izvajanje apoptotičnega programa, odvisno od vrste celice in specifičnosti proapoptotičnega signala. Raznolikost in multivariantnost signalnih poti apoptoze zagotavlja celici proste kapacitete za izvedbo tako pomembnega programa za celico in hkrati naredi ta program zelo odvisen od številnih zunanjih in notranjih vplivov.

E.B. Vladimirskaja

Razvoj apoptoze lahko razdelimo na tri faze. Bistvo prvega od njih je sprejem signala in začetne faze njegovega prenosa; ta faza je reverzibilna. Druga faza, aktivacija kaspaz, je ključni dogodek v razvoju apoptoze; vodi do nepopravljivih posledic. Tretja faza je sestavljena iz izvedbe celične smrti, programirane v prejšnji fazi. Manifestacije prve faze razvoja apoptoze so raznolike. Druga in tretja faza potekata bolj standardno. Po sodobnih pojmovanjih se poti in mehanizmi za sprožitev apoptoze reducirajo na dva mehanizma - receptorski in mitohondrijski, ki sta shematsko prikazana na sliki 51.

Receptorski mehanizem za sprožitev apoptoze je bil najbolj podrobno raziskan. Specializirani RC se lahko izražajo na celični površini in prenašajo signale za razvoj apoptoze. Njihova splošna oznaka je "receptorji smrti" (DR). Ti RC spadajo v družino RC faktorja tumorske nekroze (TNF). Od drugih RC te skupine se razlikujejo po prisotnosti v citoplazmatskem delu posebne "domene smrti" (DD), ki je potrebna za vklop znotrajceličnega signala, ki vodi do razvoja apoptoze. Do danes je bilo opisanih 6 DR-Rc. Med njimi je najbolj znan Fas-Rc (APO-1, CD95). Njegov ligand je trimerna molekula iz družine TNF - Fas-ligand (FasL, CD178). Poznani sta membranska in topna oblika FasL, od katerih je prva bistveno učinkovitejši induktor apoptoze celic fenotipa CD95 kot druga. Družina DR vključuje tudi TNF–R1 - tip 1 TNF PCR (p55, CD120A), medtem ko tip 2 PCR (p75, CD120B) nima domene "smrti" in ne vključuje neposredno apoptogenih signalov. Liganda za TNF-R1 sta molekuli družine TNF - TNF a in limfotoksin a (TNF b). DR3 rc prenaša signale iz premalo označene molekule DR3L (APO3-L). DR4 in DR5 služita kot RC za molekulo TRAIL. Ta trimer, ki prav tako spada v družino TNF, se veže tudi na PCR pasti DcR1 in DcR2, ki povzročita uničenje TRAIL. V zvezi s tem TRAIL nima pomembne vloge pri indukciji apoptoze normalnih celic, inducira pa apoptozo tumorskih celic, v katerih pasti RC ni ali so šibko izražene. Narava liganda DR6 še ni bila ugotovljena.

V vseh primerih interakcija trimernih ligandov z RC vodi do trimerizacije slednjih, kar je predpogoj za njihovo delovanje kot prenašalcev apoptotičnih signalov. V tem primeru domene smrti pridobijo sposobnost interakcije s podobnimi domenami adapterskih proteinov FADD (domena smrti, povezana s Fas) in TRADD (domena smrti receptorja TNF). FADD prepozna domene smrti v prokaspazi 8 in v interakciji z njimi povzroči aktivacijo kaspaze 8. Rezultat TRADD je podoben, vendar se realizira prek FADD. Molekularni kompleksi, ki nastanejo kot posledica teh interakcij, se imenujejo DISC (Death–inducing signaling complex). Receptorska pot za omogočanje apoptoze ne zahteva sinteze RNA in beljakovin de novo. Ker apoptozo sproži aktivni učinek na celične RC, jo označujemo kot aktivno apoptozo.



Druga skupina mehanizmov za sprožitev apoptoze se realizira v pogojih pomanjkanja rastnih faktorjev, ko je celica tako rekoč prepuščena sama sebi (apoptoza "privzeto" - slika 51). To obliko apoptoze imenujemo tudi pasivna apoptoza. Mehanizem pasivne apoptoze se uporablja med celično smrtjo pod vplivom stresnih dejavnikov (vključno s sevanjem), glukokortikoidov in številnih strupenih snovi, na primer citostatikov, ki se uporabljajo v onkološki praksi. V teh primerih so osnova apoptoze procesi, ki se sprožijo v mitohondrijih in zmanjšajo na povečanje prepustnosti njihove membrane za proapoptotične dejavnike.

riž. 51 . Razvoj apoptoze: prikazana sta dva mehanizma za vklop apoptoze - povzročen s povečanjem mitohondrijske permeabilnosti (apoptoza “privzeto”) in receptorski (“aktivacija”). Oba mehanizma vodita do izvajanja apoptoze v skladu z enim efektorskim mehanizmom. TRAIL je ligand, ki inducira apoptozo, povezano s faktorjem tumorske nekroze; FasL - ligand za РсFas (iz liganda Fas); TNFRI - RC za faktor tumorske nekroze I (iz receptorja TNF I); DR - RC "smrti" (od - Death receptor); FADD - domena "smrti" RC Fas (iz domene smrti, povezane s Fas); TRADD - domena "smrti" RC za faktor tumorske nekroze (iz domene smrti, povezane s TNF-receptorjem). Poleg ikon, ki simbolizirajo dejavnike, so navedena njihova imena. Polne puščice pomenijo transformacije, pikčaste puščice pomenijo vplive, črtkane puščice pomenijo premike dejavnikov. Pojasnila v besedilu.



Mnoge celice (morda večina njih) potrebujejo posebne signale, da ohranijo svojo sposobnost preživetja. Vir takšnih signalov preživetja so običajno citokini in kontaktne interakcije z okoliškimi celicami. Če v celici ni signalov za preživetje, je delovanje mitohondrijev oslabljeno, zlasti mehanizmi glikolize in defosforilacije ATP. Ker sta ADP in glikolitični produkt piruvat nujna za normalno izvajanje oksidativne fosforilacije, transport elektronov in ustvarjanje protonskega gradienta, so ti procesi moteni, kar povzroči poškodbo mitohondrijske membrane.

Vzporedno se sproži mehanizem, ki ga realizirajo proteini - produkti protoonkogenov družine Bc1–2. Te beljakovine delimo v več skupin. Nekateri proteini vsebujejo 3-4 domene BH (BH - iz homologije Bcl-2) in jih delimo na antiapoptotične (Bcl-2, Bcl-X L, Mcl-1 itd.) in proapoptotične (Bax, Bak , Bcl–X S itd.) dejavniki. Posebno skupino sestavljajo “samo BH3” proteini (“BH3-only” - Bad, Bid, Bik, Bim, Noxa, Bbc3 itd.), ki v skladu z imenom vsebujejo le eno domeno BH - BH3, in v drugih pogledih se razlikujejo od proteinov obravnavane družine. Vloga privzetih sprožilcev apoptoze je dodeljena proteinom "samo BH3", predvsem Bim, mobiliziranim iz citoskeleta. Do ekspresije ali aktivacije proteinov »samo BH3« pride v pogojih pomanjkanja citokinov in drugih dejavnikov preživetja, pa tudi med aktivacijo proteina p53, ki je senzor prelomov DNA (v slednjem primeru »samo BH3«). aktivirata se faktorja Noxa in Bbc3). Proteini "samo BH3" blokirajo anti-apoptotične faktorje, kot je Bcl-2, z njimi tvorijo dimere in spodbujajo manifestacijo aktivnosti pro-apoptotičnih faktorjev. Ključna manifestacija delovanja slednjega je tvorba transmembranskih por, ki nastanejo kot posledica oligomerizacije Bax in Bac, ki jo običajno zavirajo antiapoptotični dejavniki.

Skozi pore v mitohondrijski membrani prideta v citosol citokrom C in APAF-1 (Apoptose Protease Activation Factor 1). APAF-1 se sprosti iz mitohondrijske membrane: faktor Bik ga izpodrine iz heterodimera s faktorjema Bc1-2 ali BCL-X L, v katerih se zadrži v membrani. APAF–1 in citokrom C v prisotnosti ATP tvorita kompleks z neaktivno kaspazo, prokaspazo 9. Ta kompleks se imenuje apoptosom. V njem pod vplivom APAF-1, ki prepozna homologno domeno v prokapazi, pride do aktivacije kaspaze 9. V nasprotju z receptorskim mehanizmom izvajanje mitohondrijske poti apoptoze zahteva izražanje številnih genov in sintezo de novo RNA in beljakovine.

Pred aktivacijo kaspaze je proces apoptoze reverzibilen. Blokada širjenja apoptotičnega signala vzdolž poti rane poteka na različne načine. Receptorski mehanizem apoptoze lahko prekinemo zaradi aktivacije skupine faktorjev FLIP (FLICE-inhibitory proteins; FLICE - staro ime za kaspazo 8), ki vsebujejo efektorske domene smrti, značilne za kaspazo 8, nimajo pa njenega katalitičnega centra. . Posledično kompetitivno blokirajo delovanje te kaspaze. Mitohondrijski mehanizem aktivacije apoptoze blokirajo zgoraj omenjeni anti-apoptotični dejavniki družine Bc1–2, predvsem sam Bc1–2 in Bcl–X L. Učinek Bc1–2 je povezan predvsem z njegovo sposobnostjo, da veže faktorje "samo BH3" in prepreči njihov stimulativni učinek na tvorbo kompleksov Bax-Bak. Bcl-2 se prav tako lahko veže neposredno na Bax in Bak ter na Apaf-1. Ti mehanizmi preprečujejo nastanek transmembranskih por v mitohondrijih in/ali nastanek apoptosomov. Omeniti je treba tudi "sfingomielinski reostat" - mehanizem za nadzor ravnovesja proliferacije in apoptoze, ki ga izvajajo presnovki sfingomielina, med katerimi ima ceramid vlogo proapoptotičnega faktorja.

Torej obe poti apoptoze vodita do aktivacije kaspaz. Kaspaze so skupina cisteinskih proteaz, ki cepijo polipeptidno vez po ostankih asparaginske kisline. Razlika v specifičnosti med posameznimi kaspazami je posledica prepoznavanja različnih tetrapeptidov, ki mejijo na mesto preloma z NH 2 koncem. Receptorska pot vodi do aktivacije kaspaze 8 (redkeje kaspaze 2 in 10), mitohondrijska pot vodi do aktivacije kaspaze 9. Ti encimi spadajo v skupino iniciatorskih kaspaz. V svoji neaktivni obliki (prokaspaze) vsebujejo skupaj z dvema proteaznima domenama dve domeni smrti (prokaspazi 8 in 10) za interakcijo s FADD in drugimi adapterskimi proteini ali domeno, ki rekrutira prokaspazo v apoptosom (prokaspazi 9 in 2). Njihova aktivacija je posledica agregacije, ki nastane kot posledica interakcije z adapterskimi proteini (FADD, Apaf-1) in povzroči avtokatalitsko cepitev dolge N-terminalne regije. Med aktivacijo molekule se domene reorganizirajo in nastane aktivni heterodimer (p18/p11-p18/p11 tetramer v primeru kaspaze 8, trimer v primeru kaspaze 9). Po aktivaciji iniciatorskih kaspaz postane proces apoptoze ireverzibilen.

Iniciatorske kaspaze povzročijo delno proteolizo (odcepitev kratke pro-domene) in posledično aktivacijo izvršilnih ali efektorskih kaspaz 3, 6 in 7. Najpomembnejša in univerzalna v svojem sodelovanju pri apoptozi je kaspaza 3. Aktivna kaspaza 3 je dimer p17/p12. Izvršne kaspaze nastajajo tudi pod delovanjem grancima B, serinske proteaze, ki se prenaša v tarčne celice iz limfocitov ubijalk (T in NK).

Tarče izvršnih kaspaz so številni proteini, katerih velik del je lokaliziran v jedru. Celoten spekter manifestacij apoptoze določa cepitev ciljnih molekul. Ena od glavnih tarč kaspaze 3, endonukleaza CAD (Caspase-activated DNase), se aktivira kot posledica cepitve inhibitorne podkomponente. Aktivirani CAD razgradi DNK z delovanjem na dostopne regije molekule, ki se nahajajo med nukleosomi. Cepitev jedrskih encimov PARP (poli-ADP-riboza polimeraza) in od DNA odvisne protein kinaze z isto kaspazo blokira proces popravljanja DNK. Delovanje kaspaz na faktor retinoblastoma (Rb) in d-izoformo protein kinaze C določa motnjo nadzora celičnega cikla. Cepitev MNK-1 in FAK kinaz vodi do sprememb, ki povzročijo oslabitev celične adhezije, cepitev gelsolin in PAK kinaze pa določa značilne spremembe v celični morfologiji.

Omenili smo že, da se celice, ki so podvržene apoptozi, hitro fagocitirajo. To je olajšano z izražanjem na površini apoptotičnih celic številnih molekul, ki jih prepoznajo fagociti in olajšajo proces fagocitoze. Tako je med apoptozo porušena asimetrija membrane in fosfatidilserin, ki je običajno lokaliziran na notranji površini membrane, je izpostavljen na površini. Prepozna ga makrofagna molekula CD14 in morda drugi RC. Proste sladkorne ostanke, ki nastanejo kot posledica desialilacije membranskih glikokonjugatov, prepoznajo membranski lektini fagocitov. Trombospondin, ki se pojavi tudi na površini apoptotičnih celic, prepoznajo adhezijske molekule - integrin a 2 b 2 in CD36, preko katerih se prenašajo signali v notranjost fagocitne celice in aktivirajo njeno presnovo. Lizosomska DNaza II zaključi razgradnjo DNA apoptotične celice že znotraj fagocita. Zaradi hitre fagocitoze in odsotnosti sproščanja znotrajcelične vsebine v medceličnino, odmirajoča celica le-te ne »kontaminira« in v proces odmiranja ne vključi sosednjih celic, kar je pomembna razlika med apoptozo in nekrozo.

Zaradi intenzivne fagocitoze apoptotičnih celic jih je težko prepoznati in situ. Identifikacija procesa apoptoze ni omejena na beleženje morfoloških sprememb v celicah (to je preveč subjektiven pokazatelj). Temelji na številnih značilnostih procesa, ki smo jih obravnavali zgoraj (slika 52). Večina metod za določanje apoptoze temelji na detekciji razgradnje DNK. Do nedavnega je bila elektroforeza fragmentov DNA, ekstrahiranih iz celice, uporabljena kot glavna in najbolj zanesljiva metoda za določanje celične apoptoze: za apoptozo je značilna "lestev", to je prisotnost fragmentov, ki so večkratniki dolžine DNA. v nukleosomu, ki se med elektroforezo pojavi v obliki diskretnih frakcij. Za identifikacijo nepopravljenih prelomov DNA se uporablja metoda TUNEL (TdT-mediated dUTR-biotin Nick End Labeling), ki temelji na terminalni deoksinukleotidil transferazi (TdT) kataliziranem dodajanju označenih nukleotidov na prosti 3" konec verige DNA, čemur sledi odkrivanje označenih celic z imunohistokemičnimi ali citofluorometričnimi metodami Kot presejalno metodo se uporablja citofluorometrično odkrivanje hipodiploidnih celic (tj. celic, ki so izgubile del DNK zaradi njene razgradnje) z barvanjem s propidijevim jodidom... Druga široko uporabljena citofluorometrična metoda za določanje apoptoze se uporablja za odkrivanje izražanja fosfatidilserina v celicah, ki je sposoben vezati anekse s fluorokromom označenim V. Kombinacija obarvanja z aneksinom in propidijevim jodidom omogoča razlikovanje apoptotičnih in nekrotičnih celic (le slednje so obarvane s propidijem brez predhodne fiksacije ).

riž. 52 . Metode za določanje apoptoze. a - diagrami elektroferogramov oligonukleotidov, ki ponazarjajo različne manifestacije razgradnje DNA med apoptozo (na levi - "lestev", ki odraža posledice internukleosomske razgradnje DNA s tvorbo diskretnih frakcij) in nekrozo (na desni - trdna točka). , ki odraža neurejeno razgradnjo DNA), b - histogram, dobljen s citofluorometrično analizo fiksnih celic, obarvanih na DNA s propidijevim jodidom. Glavni vrh ustreza diploidnim celicam, vrh na desni - celicam v celičnem ciklu, vrh na levi, označen s kazalcem M1 - hipodiploidnim celicam, ki so zaradi apoptoze izgubile del svoje DNK - 28,7% od skupno, c - rezultati citofluorometrične analize nefiksiranih celic, obarvanega konjugata aneksina V s fluorescein izotiocianatom (vzdolž osi abscise) in propidijevim jodidom (vzdolž osi ordinate). Žive celice so prisotne v spodnjem levem kvadrantu. Spodnji desni kvadrant vsebuje celice, ki so bile podvržene apoptozi (vežejo aneks V, vendar so neprepustne za propidijev jodid), levi zgornji kvadrant vsebuje celice, ki so bile podvržene nekrozi (neprepustne za propidijev jodid, ne vežejo aneksa V), desni zgornji kvadrant verjamejo, da so celice podvržene apoptozi, ki se spremeni v nekrozo.

1) Receptor. Izvaja se z uporabo "receptorjev smrti" z aktiviranjem interakcije z ustreznimi ligandi, ki večinoma pripadajo superdružini faktorja tumorske nekroze. Interakcija receptorja z ligandom vodi do aktivacije adapterskih proteinov, povezanih z "domenami smrti" (FADD - domena smrti, povezana s Fas, TRADD - domena smrti, povezana s TNF-R), in prokaspazo 8, katere produkt, kaspaza 8 (iniciator), aktivira kaspazo 3 (efektor), ta pa povzroči aktivacijo endonukleaz, ki fragmentirajo DNA.

2) mitohondrijski. Sodelovanje mitohondrijev pri apoptozi je zagotovljeno s prisotnostjo v njihovem matriksu in medmembranskem prostoru velikega števila biološko aktivnih snovi (citokrom C (Cyt C); prokaspaze 2, 3, 9; apoptozo inducirajoči faktor (AIF), ki imajo izrazit apoptogeni učinek Aktivacijski faktor apoptoze je sproščanje teh snovi v citoplazmo z zmanjšanjem transmembranskega potenciala mitohondrijev zaradi odpiranja velikanskih mitohondrijskih por (ki igrajo vlogo Ca 2 + -, pH -, potencial -, NADP2H/NADP + - in redoks-odvisni kanali) in povečanje prepustnosti mitohondrijskih membran Odpiranje por je posledica zmanjšanja reduciranega glutationa v celicah, NADPH, ATP in ADP, tvorba reaktivnih kisikovih spojin , odklop oksidativne fosforilacije, povečanje vsebnosti Ca 2 + v citoplazmi.Vstop intermembranskih proteinov in aktivacija apoptoze sta možna tudi ob pretrganju zunanje mitohondrijske membrane zaradi hiperpolarizacije notranje membrane.

3) posredovano s p53. p53 je multifunkcionalni protein, ki ima pomembno vlogo pri spremljanju signalov o stanju celice, celovitosti njenega genoma in aktivnosti sistemov za popravilo DNA. Poškodba DNK povzroči kopičenje proteina p53 v celici. To določa zaustavitev celičnega cikla v fazah G 1 in G 2, preprečuje replikacijo, aktivira sintezo in popravilo DNA in s tem ustvarja pogoje za obnovo naravne strukture DNA in preprečuje pojav mutantnih in aneuploidnih celic v telesu. Če sistemi za popravilo DNK niso zadostni in poškodba DNK še vedno obstaja, je celica podvržena apoptozi. Zlasti protein p53 je sposoben inducirati transkripcijo takih apoptogenih dejavnikov, kot so Bax, Fas receptor, DR-5 itd.

4) Perforin granzim. Citotoksični limfociti T (celice T ubijalke) inducirajo apoptozo ciljnih celic (npr. okuženih celic) z uporabo proteina perforina. S polimerizacijo perforin tvori transmembranske kanale v citoplazemski membrani tarčne celice, skozi katere v celico vstopajo granzimi (fragmentini), ki jih izloča T-ubijalec - mešanica serinskih proteaz. Glavna sestavina te mešanice je granzim B, proteolitični encim, ki aktivira kaspazo 3.

Pomen proteinov-regulatorjev apoptoze v razvoju telesa in patoloških procesov

    Bcl-2 potrebni za ohranjanje sposobnosti preživetja limfocitov, melanocitov, črevesnega epitelija in ledvičnih celic med embrionalnim razvojem.

    Vcl-x nujen za zaviranje celične smrti v embriogenezi, zlasti v živčnem sistemu.

    Bax nujen za apoptozo timocitov in ohranjanje sposobnosti preživetja semenčic med njihovim razvojem.

    str53 je gen za supresijo tumorja, zato nima posebne vloge v embriogenezi, je pa nujno potreben za supresijo rasti tumorja.

    Povečana sinteza proteina, ki ga kodira gen bcl-2, povzroči zatiranje apoptoze in s tem razvoj tumorjev; ta pojav so odkrili v celicah B-celičnega folikularnega limfoma.

    Pri limfoproliferativnih boleznih in bolezni, podobni sistemskemu eritematoznemu lupusu pri miših, je funkcija liganda Fas ali receptorja Fas oslabljena.

    Povečana sinteza Fas ligand preprečuje zavrnitev presadka.

Apoptoza je del patološkega procesa, ko so celice okužene z adenovirusi, bakulovirusi, HIV in virusi influence.

Inhibicijo apoptoze v gostiteljski celici opazimo pri perzistentni okužbi, v latentnem obdobju, pri povečanem razmnoževanju adenovirusov, bakulovirusov, morda herpesvirusov, virusa Epstein-Barr in HIV pa opazimo aktivacijo apoptoze v celicah imunskega sistema, kar prispeva k širjenju virusa.



 

Morda bi bilo koristno prebrati: