Апоптоз. Визначення

1007 0

Основне завдання системи, що регулює апоптоз,- тримати ефекторні каспази, що демонтують клітини, у неактивному стані, але швидко переводити їх у активну форму у відповідь на мінімальну дію відповідних індукторів.

Функцію активації ефекторних каспаз беруть він каспазы-индукторы, основними представниками яких є каспаза 8 і каспаза 9.

Ці каспази при стані клітини неактивні, існують у формі прокаспаз. Звідси дія різноманітних проапоптотичних сигналів спрямовано активацію каспази 8 і каспази 9.

Відповідно до цього виділяють 2 типи провідних сигнальних шляхів:

1) Пошкодження ДНК, радіація, дія токсичних агентів, дія глюкокортикоїдів, припинення цитокінової регуляції, скорочення до критичного рівня теломерів – активація каспази 9;
2) Проапоптотичні сигнали, що виникають при активації рецепторів «регіону клітинної смерті» (наприклад, Fas-R, TNF-R) – активація каспази 8.

Розглянемо послідовно кожен із цих шляхів, схематично представлених на рис. 1.4.

Сигнальні шляхи активації каспази 9

Сенсором ушкодження ДНК та порушень у клітинному циклі є ген Р53.

Р53-ген

Ген Р53, розташований на короткому плечі хромосоми 17, кодує утворення ядерного білка, що складається з 393 амінокислот, з молекулярною масою 53 Kd. Тетрамер Р53 функціонує як транскрипційний фактор, зв'язуючись своїм карбоксильним закінченням зі специфічними регіонами генів-мішеней. Білок Р53 знаходиться у цитоплазмі у латентному стані.

В останні роки показано, що активація його відбувається не тільки у відповідь на ураження ДНК, але також може з'явитися і наслідком багатьох інших процесів, що відбуваються в клітині, у тому числі активації онкогенів, гіпоксії, дефіцит харчування, старіння та інших. Недарма цей ген отримав в одних авторів назву «Пан нічний сторож», а в інших – «Зберігач геному».

При активації Р53 білок здатний ініціювати незалежно один від одного 2 програми:

Тимчасову зупинку клітинного циклу в G1/S фазі за допомогою білка p21 WAF1, що інгібує циклінзалежні кінази
Стимуляцію апоптозу шляхом активації гена Вах - проапоптотичного гена сім'ї Всl-2 та/або активації утворення вільних форм кисню, що сприяють виходу цитохрому-З мітохондрій.

Експериментальні дані, що з'явилися в останні роки, з виключення генів дозволяють припустити, що пріоритетною для більшості клітин є програма тимчасової зупинки мітотичного циклу. Є відомості і про участь Р53 у процесах репарації ДНК шляхом активації знову відкритого гена P53R2, що кодує редуктазу рибонуклеотид. Програма апоптозу включається при неможливості репарувати клітиною ДНК під час «арешту» при проходженні мітотичного циклу та/або дефіциті білка p21 WAF1 . У деяких клітинах генетично обумовлений пріоритет програми апоптозу під час активації Р53 гена.

Роль Р53 - тканезалежна. У мишей в експерименті з виключенням цього гена радіація не викликала апоптозу в лімфоцитах, але в легеневій тканині ознаки апоптозу були яскраво виражені.

Малюнок 1.4. Основні шляхи апоптозу. Вах, Bid – проапоптотичні гени сім'їНд-2. dATP – аденозинтрифосфорна кислота. APAF-1 - апоптотичний протеазактивуючий фактор

На малюнку представлені основні шляхи апоптозу, що реалізують проапоптотичні сигнали двох основних типів: пошкодження ДНК радіацією або цитотоксичними агентами) та активація рецепторів «регіону клітинної смерті».

Пошкодження ДНК спричинює активацію гена Р53. Подальше проходження апототичного сигналу цього відбувається через активацію проапоптотических генів сім'ї Всl-2 (Вах і Bid). Білки цих генів викликають пермеабілізацію мембрани мітохондрій та вихід у цитозоль Цитохрома С, аденозинтрифосфорної кислоти (dATP), апоптоз індукуючого фактора (Aif) та ДНКази Цитохром С разом з dATP активує білок APAF-1, що знаходиться в цитозолі, утворюючи апоптосому, в якій відбувається активація каспази-9. Остання активує каспазу-3 – основний «екзек'ютор» каспазного каскаду.

Після цього активуються інші каспази, протеази і ДНКази, відбувається апоптоз. Вивільнені з мітохондрій Aif та ДНКаза виконують додатковий позакаспазний шлях апоптозу, реалізують свою активність безпосередньо в ядрі.

Зв'язування рецепторів «регіону клітинної смерті» з відповідними лігандами призводить до активації каспаз 8, здатної до незалежної активації каспаз 3. На цьому шляху може відбуватися і додаткове залучення сім'ї Вс-2 генів шляхом активації каспазою 8 білків гена Bid.

Проте основною функцією гена Р53 слід вважати включення програми апоптозу при пошкодженні клітинного геному, що можна розглядати як захисну реакцію організму від накопичення генетично дефектних клітин. Зниження активності гена Р53 або мутація в ньому, що призводить до втрати здатності до включення апоптозу, є серйозним фактором, що спричиняє виникнення пухлин та розвитку резистентності до хіміотерапії.

Мутація гена Р53 виявляється більш ніж у половині ракових пухлин, частота її підвищується за тривалої хіміотерапії. У дітей мутація в гені Р53 частіше спостерігається при Т-ОЛЛ, становлячи близько 12% і є прогностично несприятливим чинником.

Отже, ген Р53 необхідний реалізації програми апоптозу при пошкодженні ДНК і токсичних впливах на клітину. Як це видно на схемі (рис.4), наступним кроком у проведенні проапоптотичного сигналу цим шляхом є включення сім'ї Всl-2 - генів.

Сім'я Bcl-2-генів

Інтерес до апоптозу різко зріс у середині 80-х років, коли було виявлено, що посилення активності онкогену Вl-2, що є наслідком звичайної для В-клітинної фолікулярної лімфоми людини транслокації t (14; 18), призводить до утворення пухлинного клону не за рахунок посилення проліферації, а внаслідок підвищення виживання пухлинних клітин.

Пізніше було показано, що при цій транслокації онкоген Вl-2, що спочатку розташовувався на хромосомному сегменті 18q21, зливається з локусом, що кодує важкий ланцюг Ig на хромосомі 14q32, що призводить до його підвищеної експресії. Молекулярно-генетичні дослідження наступного десятиліття показали, що в так звану сім'ю Всl-2 генів, картованих у людини на 18 хромосомі, входять і інші гени, що експресують білки з протилежною функцією (див.табл.1.1).

Таблиця 1.1. Склад сім'їНд-2генів

* позначає число консервативних послідовностей, відомих як регіони, гомологічні Всl-2. **** - 4 регіони (ВН1-ВН4); *** - 3 регіони (ВН1-ВНЗ); ** - 2 регіони (ВНЗ, ВН4); * - 1 регіон (ВНЗ); СООН-кінцевий гідрофобний домен, відповідальний за прикріплення білків до зовнішньої платівки мітохондріальної мембрани.

Нині клоновано 16 генів, що становлять цю сім'ю. Білки, похідні цих генів, поєднує подібний морфологічний склад - кожен із новачків має хоча б одну з 4-х консервативних амінокислотних послідовностей, притаманних Всl-2-гена. Ці послідовності відомі як регіони, гомологічні Вl-2 (ВН1-ВН4). Функціональне значення цих регіонів остаточно неясно, але на думку деяких дослідників, саме вони забезпечують реактивні здібності білкам цієї сім'ї.

Як випливає з поданих у табл.1.1. даних, лише 6 з них надають, подібно до засновника цієї сім'ї -Всl-2 гену, антиапоптотичну дію: захищають клітини від широкого спектра фізіологічних та експериментальних впливів, спрямованих на індукцію апоптозу. До таких стимулів відносяться пошкодження ДНК, дія глюкокортикоїдів, припинення цитокінової регуляції та ін. Деякі з білків цієї групи мають СООН-кінцевий гідрофобний регіон, відповідальний за прикріплення білків до зовнішньої поверхні мітохондріальної мембрани.

Інші 10 членів сім'ї - Всl-2 викликають апоптоз. Ці проапоптотичні білки можуть бути поділені на 2 підгрупи в залежності від числа ВН регіонів, які вони мають. Перші 4 (див.табл.1.1.) мають по 2-3 ВН-регіону, тоді як у 6 інших виявляється лише один ВНЗ-регіон. Саме із цим регіоном пов'язують проапоптотичну функцію білків. Багато проапоптотичних білків також, як антиапоптотичні білки цієї сім'ї, мають кінцевий гідрофобний домен, але на відміну від останніх, не прикріплюються до мітохондрії до отримання проапоптотичного сигналу.

Сприйняття анти- чи проапоптотичних сигналів членами сім'ї Всl-2 відбувається як на рівні генів (так, білок Р53 підвищує експресію гена Вах) так і на рівні посттранскрипційних білків (дія цитокінів). При цьому між самими білками спостерігаються складні взаємодії, іноді в антагоністичній манері. У процесі цих взаємодій про- та антиапоптотичні протеїни можуть утворювати гомо- та гетеродимери як усередині своєї групи, так і з протеїнами протилежної спрямованості дії (див. рис. 1.5). Деякі зв'язки між промоторами та супресорами клітинної смерті високо специфічні (наприклад, Воk та Мс1-1), інші швидше випадкові.

Малюнок 1.5. Способи взаємодій між білками сім'їНд-2

Значення цих взаємодій поки що прояснено лише щодо проапоптотичних білків, що мають один ВНЗ домен. Ці білки здатні реалізувати свою проапоптотичну активність тільки в антагоністичній манері, утворюючи гетеродимери з білками антиапоптотичними сім'ї Всl-2. Це правило не поширюється усім членів сім'ї; Bcl-xL наприклад, для вираження своєї антиапоптотичної активності не вимагає зв'язку з промотором клітинної смерті.

Малюнок 1.6. Схильність до апоптозу. Відношення числа гомодимерів до гетеродимерів визначає схильність до апоптозу.

В результаті численних експериментів до теперішнього часу склалося враження, що рішення жити або померти клітині приймається на рівні сім'ї Всl-2 на підставі відносної переважання активних супресорів або промоторів апоптозу. Це положення схематично проілюстровано на рис. 1.6.

Як же відбувається реалізація цього рішення, що необхідно для подальшого просування сигнальним шляхом, кінцевим пунктом якого має стати активація індукторної каспази 9?

Про- та антиапоптотичну дію активованих білків сім'ї Всl-2 реалізується головним чином через модуляцію активності мітохондрій.

Роль мітохондрій у процесах апоптотичної смерті клітин

Мітохондрія- матрикс, утворений клітинними органелами та оточений двошаровою мембраною. Мітохондрія містить геном, здатний кодувати обмежену кількість РНК і білків, необхідних для її функції, однак, більшість компонентів мітохондрії кодуються в ядрі, а потім імпортуються в неї. Роль мітохондрій у підтримці життя велика - є основним джерелом клітинної енергії, утворюючи АТФ з АДФ з допомогою окислювального фосфорилирования. У той же час багато дослідників вважають мітохондрії ключовою фігурою апоптозу.

Це з тим, що мітохондрії є джерелом цитохрому З, АТФ, Са++, АІФ (апоптоз, що індукує фактор)- компонентів, необхідні подальшого просування апоптотичного сигналу. Вихід цих чинників з мітохондрії здійснюється лише за взаємодії її мембрани з активованими білками сім'ї Всl-2. Багато чого в цьому процесі вимагає уточнення, проте, схематично його можна подати в такий спосіб. Активовані білки сім'ї Всl-2 своїми СООН – гідрофобними основами, як якорями прикріплюються до зовнішньої мембрани мітохондрій.

Відбувається це в місцях зближення зовнішньої та внутрішньої мембран, де, мабуть, фізіологічно існують пермеабілізаційні пори, звані мегаканалами, з діаметром, що не перевищує 2nm. Ці пори функціонують як сенсори багатьох фізіологічних параметрів і таким чином передають інформацію про основні метаболічні процеси, що відбуваються в клітині. Вони є каналами для Са2+, вольтажу, РН, активних форм О2, але не пропускають деякі аніони і непрохідні для великих молекул Цитохрому С, АТФ і Аіф, необхідних для апоптозу.

Було показано, що проапоптотичні білки сім'ї Всl-2 (Вах, Bad, Bak та ін.), укорінившись у зовнішній мембрані, вступають у з'єднання з ANT (adenin-nucleotid-translocator), вбудованим у внутрішню мембрану в цих локусах, утворюючи тимчасово більше великі мегаканали (діаметр 2,4-3 нм). Ці канали в цитозоль клітини надходять Цитохром С, АТФ і апоптоз індукувальний фактор. Антиапоптотичні білки сім'ї Всl-2 не здатні пермеабілізувати мембрану мітохондрій, а за деякими даними, навпаки, закривають вже існуючі канали, перериваючи таким чином просування проапоптотичного сигналу та захищаючи клітину від апоптозу. Яким є призначення проапоптотичних мітохондріальних сигнальних молекул?

Цитохром-С- Білок з молекулярною масою 15 kDa, кодується ядерним геномом, синтезується як апоцитохром С, імпортується в мітохондрію, де прикріплюється до внутрішньої поверхні мембрани і виходить у цитозоль через мегаканали, відкриті для нього проапоптотичними білками сім'ї Всl-2 (Вах, Ba ін). Цитохром-С необхідний освіти апоптосомы, де відбувається активація каспази 9, яка потім, своєю чергою, активує основну «кілерну» каспазу 3 (див. рис. 1.4). Так завершується сигнальний шлях апоптозу, спричинений пошкодженням ДНК.

Апоптосома являє собою комплекс APAF-1 (apoptotic protease activating factor), цитохром-С, каспази-9 і АТФ. До з'єднання з Цитохромом APAF-1 існує в цитозолі в неактивному стані. За відсутності достатньої кількості АТФ утворення апоптосоми не відбувається і загибель клітини йде некротичним шляхом.

Разом з Цитохромом-С та АТФ з мітохондрій у цитозоль клітини виходить також АІФ (апоптоз фактор, що індукує). Синтез цього фактора також кодується ядерним геномом, перетворення на зрілу форму (білок з молекулярною масою 75 kDa) відбувається у мітохондрії. Вийшовши з мітохондрії, АІФ прямує в ядро клітини, де викликає фрагментацію ДНК, що нагадує апоптоз. Оверекспресія Всl-2 перешкоджає виходу апоптоз фактор, що індукує з мітохондрій, але не його активності при введенні АІФ в клітину в експерименті. АІФ не вимагає цитозолевой активації, виділяється з мітохондрії до цитохрому-С і, можливо, сприяє його виходу. Таким чином, апоптоз індукувальний фактор є самостійним "кілерним" фактором, що дублює дію Цитохрома-С і каспаз при їх блокуванні.

Цікаво, що в процесі апоптозу мітохондрія не втрачає своєї цілісності і не руйнується.

Перелічені тут події лягли в основу гіпотези, за якою мітохондрія є ключовою фігурою апоптозу. Однак існує і альтернативна гіпотеза, що вважає основним мотором апоптозу каскадну активацію каспаз, при цьому вивільнений з мітохондрій Цитохром є не ініціатором, а лише підсилювачем апоптотичного каскаду. Останні уявлення підтримуються даними, що активність сім'ї Всl-2 може підтримуватися і участі мітохондрій. Показано, що антиапоптотичні білки цієї сім'ї можуть утворювати в цитозол комплекс з APAF-1, що блокує його активність. Інгібіція зв'язку проапоптотическими членами сім'ї Всl-2 вивільняє APAF-1 і дозволяє йому активувати каспазу 9.

Сигнальний шлях активації каспази 8

Передача проапоптотичного сигналу при зв'язку ліганду з рецепторами регіону клітинної смерті відбувається посідством адапторних білків FADD/MORT1, чий N-термінальний регіон (DED) у свою чергу пов'язується з аналогічним регіоном прокаспази-8, викликаючи її аутокаталітичну активацію (рис. 1.4 і рис. 1.7). При активації деяких членів сім'ї TNF-рецепторів (зокрема TNF-R1) використовується додатковий адапторний білок TRADD.

Малюнок 1.7. Апоптоз, індукований сигналом "регіону клітинної смерті". FADD-fas-associated death domain (пов'язаний з FAS регіон клітинної смерті); TRADD-TNF-associated death domain (пов'язаний cTNF-R регіон клітинної смерті); DD – death domain (регіон смерті); DED – death effector domain (регіон виконавця смерті); NF-kB, АР-1 - транскрипційні фактори, що активують прозапальні та імуномодуляторні гени

Рецепторний шлях клітинної смерті є більш коротким, ніж апоптотичний каскад, ініційований пошкодженням ДНК і розглянутий вище: за допомогою адаптерних молекул відбувається активація каспази 8, яка в свою чергу здатна безпосередньо активувати каспази-кати. Але це лише основна схема, насправді цей сигнальний шлях значно складніший і переплітається з іншими механізмами апоптозу. Так, відомо, що каспаза 8 здатна активувати білок Bid, що призводить, як описано вище, до викиду Цитохрома С з мітохондрій. І хоча ясно, що цей шлях не вимагає активації мітохондрій, залучення їх до процесу посилює рецептор-індукований апоптоз (див. рис. 1.4).

Цей сигнальний шлях із залученням інших адаптерних білків використовується і реалізації інших клітинних програм. Так, сигнал, що пройшов через TNF-R1, може активувати також транскрипторні фактори NF-kB і АР-1. Ці сигнальні молекули викликають активацію генів, які забезпечують продукцію факторів запалення. Таким чином, при активації TNF-R клітина повинна прийняти рішення - чи вчинити самогубство або вижити для продукції прозапальних цитокінів.

Останнє рішення приймається лімфоцитами частіше, можливо тому, що транскрипційний фактор NF-kB гальмує апоптотичні шляхи. На вибір клітини впливає, мабуть, і клітинна спільнота. Цей приклад підтверджує те, що одні й самі сигнальні шляхи використовуються реалізації різних клітинних програм, механізми вибору та прийняття рішення залишаються багато в чому неясними. Так, рецепторний шлях клітинної смерті у лімфоцитів незалежний від сім'ї Всl-2-генів і не може бути пригнічений антиапоптотической активністю.

Активація Р53 може призводити в деяких клітинних системах до трансактивації генів, що кодують рецептори регіону «клітинної смерті».

Таким чином, існують різні шляхи, що часто перехрещуються, і механізми реалізації апоптотичної програми, що залежать від клітинного типу і специфіки проапоптотичного сигналу. Різноманітність та багатоваріантність сигнальних шляхів апоптозу забезпечують клітині запасні можливості для здійснення такої важливої для клітини програми і в той же час роблять цю програму дуже залежною від багатьох зовнішніх та внутрішніх впливів.

Є.Б. Володимирська

У розвитку апоптозу можна назвати три фази. Суть першої з них - рецепція сигналу та початкові етапи його передачі; ця фаза оборотна. Друга фаза – активація каспаз – є ключовою подією у розвитку апоптозу; вона призводить до незворотних наслідків. Третя фаза полягає у реалізації загибелі клітини, запрограмованої на попередньому етапі. Прояви першої фази розвитку апоптозу різноманітні. Друга та третя фази протікають більш стандартно. За сучасними уявленнями шляхи та механізми запуску апоптозу зводяться до двох механізмів - рецепторного та мітохондріального, які схематично відображені на малюнку 51.

Найбільш детально вивчений рецепторний механізм включення апоптозу. На поверхні клітин можуть експресуватися спеціалізовані Рц, що передають сигнали розвитку апоптозу. Їх загальне позначення -Рц "смерті" (death receptors - DR). Ці Рц належать до сімейства Рц фактора некрозу пухлини (TNF). Від інших Рц цієї групи вони відрізняються наявністю в цитоплазматичній частині спеціального домену смерті (death domain - DD), необхідного для включення внутрішньоклітинного сигналу, що призводить до розвитку апоптозу. На даний момент описано 6 DR-Рц. Серед них найбільш відомий Fas-Рц (АРО-1, CD95). Його лігандом служить тривимірна молекула, що відноситься до сімейства TNF - Fas-ліганд (FasL, CD178). Відомі мембранна та розчинна форми FasL, з яких перша є значно ефективнішим індуктором апоптозу клітин фенотипу CD95, ніж друга. До DR-сімейства відноситься також TNF-R1 - Рц TNF 1-го типу (p55, CD120A), тоді як Рц 2-го типу (р75, CD120B) позбавлений домену «смерті» і безпосередньо не включає апоптогенні сигнали. Лігандом для TNF-R1 служать молекули сімейства TNF - TNF a і лімфотоксин a (TNF b). Рц DR3 передає сигнали від недостатньо охарактеризованої молекули DR3L (APO3-L). DR4 та DR5 служать Рц для молекули TRAIL. Цей трімер, що також відноситься до сімейства TNF, пов'язується, крім того, з Рц-пастками DcR1 і DcR2, що зумовлюють руйнування TRAIL. У зв'язку з цим TRAIL не відіграє суттєвої ролі в індукції апоптозу нормальних клітин, однак він індукує апоптоз пухлинних клітин, на яких РЦ-пастки відсутні або слабко експресуються. Природа ліганду DR6 поки що не встановлена.

У всіх випадках взаємодія тримірних лігандів з Рц призводить до тримеризації останніх, що є обов'язковою умовою їхнього функціонування як передавачі апоптотичних сигналів. При цьому домени смерті набувають здатності взаємодіяти з аналогічними доменами адаптерних білків FADD (Fas-associated death domain) і TRADD (TNF-receptor death domain). FADD дізнається домени смерті у складі прокаспази 8 і, взаємодіючи з ними, зумовлює активацію каспази 8. Результат дії TRADD аналогічний, але він реалізується за допомогою FADD. Молекулярні комплекси, що формуються в результаті зазначених взаємодій, називають DISC (Death-inducing signaling complex). Рецепторний шлях включення апоптозу не потребує синтезу РНК та білка de novo. Оскільки апоптоз у своїй запускається шляхом активного на клітинні Рц, він позначається як активний апоптоз.

Інша група механізмів включення апоптозу реалізується в умовах дефіциту ростових факторів, коли клітина надається сама собі (апоптоз «за замовчуванням» - рис. 51) . Цю форму апоптозу називають ще пасивним апоптоз. Механізм пасивного апоптозу використовується при загибелі клітин під дією стресорних факторів (у тому числі опромінення), глюкокортикоїдів та ряду токсичних агентів, наприклад цитостатиків, які застосовуються в онкологічній практиці. У цих випадках основою апоптозу є процеси, що запускаються в мітохондріях і зводяться до підвищення проникності їх мембрани для проапоптотичних факторів.

Мал. 51 . Розвиток апоптозу: показані два механізми включення апоптозу - обумовлений підвищенням проникності мітохондрій (апоптоз «за умовчанням») та рецепторний («активаційний»). Обидва механізми призводять до реалізації апоптозу за єдиним механізмом. TRAIL - ліганд, що індукує пов'язаний з фактором некрозу пухлини апоптоз; FasL – ліганд для РцFas (від Fas ligand); TNFRI – Рц для фактора некрозу пухлини I (від TNF receptor I); DR – Рц «смерті» (від – Death receptor); FADD - домен "смерті" Рц Fas (від Fas-associated death domain); TRADD - домен "смерті" Рц для фактора некрозу пухлини (від TNF-receptor associated death domain). Біля значків, що символізують фактори, вказано їхню назву. Суцільні стрілки означають перетворення, пунктирні – впливу, штрихові – переміщення факторів. Пояснення у тексті.

Багато клітин (можливо більшість їх) потребують спеціальних сигналах підтримки своєї життєздатності. Джерелом таких сигналів виживання зазвичай служать цитокіни та контактні взаємодії з навколишніми клітинами. За відсутності сигналів виживання у клітині порушується функція мітохондрій, зокрема механізми гліколізу та дефосфорилювання АТФ. Оскільки АДФ та продукт гліколізу піруват необхідні для нормального здійснення окисного фосфорилювання, транспорту електронів та створення градієнта протонів, ці процеси порушуються, що призводить до пошкодження мембрани мітохондрій.

Паралельно спрацьовує механізм, що реалізується білками – продуктами протоонкогенів сімейства Вс1–2. Ці білки поділяються на кілька груп. Частина білків містять 3-4 ВН-домена (ВН - від Bcl-2 homology) і поділяється на анти-апоптотичні (Bcl-2, Bcl-X L , Mcl-1 і т.д.) і про-апоптотичні (Вах, Bak , Bcl-X S і т.д.) фактори. Особливу групу складають «тільки-ВН3»-білки («ВН3-only» - Bad, Bid, Bik, Bim, Noxa, Вbс3 і т.д.), які, відповідно до назви, містять лише один ВН-домен - ВН3, а в іншому відрізняються від білків аналізованого сімейства. Саме «тільки-ВН3»-білкам, насамперед Bim, що мобілізується з цитоскелета, відводять роль пускових факторів апоптозу за умовчанням. Експресія або активація "тільки-ВН3"-білків відбувається в умовах дефіциту цитокінів та інших факторів виживання, а також при активації білка p53, що є сенсором розривів ДНК (в останньому випадку активуються "тільки-ВН3"-фактори Noxa і Вbс3). "Тільки-ВН3"-білки блокують анти-апоптотичні фактори типу Bcl-2, утворюючи з ними димери, і сприяють прояву активності проапоптотичних факторів. Ключовим проявом активності останніх є формування трансмембранних пір, які утворюються в результаті олігомеризації Вах і Вак, у нормі пригніченої антиапоптотичними факторами.

Через пори в мембрані мітохондрій у цитозоль виходять цитохром С та фактор APAF-1 (Apoptose protease activation factor 1). APAF-1 звільняється з мембрани мітохондрій: фактор Bik витісняє його з гетеродимеру з факторами Вс1-2 або BCL-X L, у складі якого він утримується в мембрані. APAF–1 та цитохром С у присутності АТФ утворюють комплекс з неактивною каспазою – прокаспазою 9. Цей комплекс називають апоптосомою. У ній під впливом APAF-1, що розпізнає гомологічний домен у прокаспазі, відбувається активація каспази 9 . На відміну від рецепторного механізму реалізація мітохондріального шляху включення апоптозу потребує експресії низки генів та синтезу de novoРНК та білка.

До активації каспаз процес розвитку апоптозу оборотний. Блокада поширення апоптотичного сигналу по ранніх шляхах відбувається по-різному. Рецепторний механізм апоптозу може бути перерваний завдяки активації групи факторів FLIP (FLICE-inhibitory protein; FLICE - стара назва каспази 8), які містять ефекторні домени смерті, властиві каспазе 8, але позбавлені її каталітичного центру. В результаті вони конкурентно блокують дію цієї каспази. Мітохондріальний механізм включення апоптозу блокується згаданими вище антиапоптотичними факторами сімейства Вс1-2, перш за все самим Вс1-2 і Bcl-XL. Ефект Вс1-2 пов'язаний головним чином з його здатністю пов'язувати «тільки-ВН3»-фактори і запобігати їх стимулюючу дію на формування комплексів Bax-Bak. Bcl-2 здатний зв'язуватися безпосередньо з Вах і Вак, а також з Apaf-1. Ці механізми перешкоджають формуванню трансмембранних пір у мітохондріях та/або формуванню апоптосом. Необхідно згадати також про «сфінгомієліновий реостат» - механізм контролю балансу проліферації та апоптозу, який здійснюється метаболітами сфінгомієліну, серед яких роль проапоптотичного фактора належить цераміду.

Отже, обидва шляхи включення апоптозу призводять до активації каспазу. Каспази – це група цистеїнових протеаз, які розщеплюють поліпептидний зв'язок після залишків аспарагінової кислоти. Відмінність окремих каспаз за специфічністю зводиться до розпізнавання різних тетрапептидів, прилеглих до місця розриву з NH 2 -кінця. Рецепторний шлях призводить до активації каспаз 8 (рідше - каспаз 2 і 10), мітохондріальний - до активації каспаз 9. Ці ферменти відносяться до групи ініціаторних каспаз. У неактивній формі (прокаспази) вони містять поряд з двома протеазними доменами два домени смерті (прокаспази 8 та 10) для взаємодії з FADD та іншими адаптерними білками або домен, що рекрутує прокаспазу до складу апоптосоми (прокаспази 9 та 2). Їх активація є наслідком агрегації, що виникає внаслідок взаємодії з адаптерними білками (FADD, Apaf-1) та викликає аутокаталітичне відщеплення довгої N-кінцевої ділянки. У процесі активації молекули відбувається реорганізація доменів та формування активного гетеродимеру (тетрамер p18/р11-р18/р11 у разі каспази 8, трімер - у разі каспази 9). Після активації ініціаторних каспазів процес апоптозу стає незворотнім.

Ініціаторні каспази викликають частковий протеоліз (відщеплення короткого про-домена) і внаслідок цього активацію виконавчих або ефекторних каспаз - 3, 6 і 7. Найбільш важливою та універсальною за своєю участю у здійсненні апоптозу є каспаза 3 . Активна каспаза 3 це димер p17/р12. Виконавчі каспази формуються також при дії гранзиму - серинової протеази, що транспортується в клітини-мішені з кілерних лімфоцитів (Т і NK).

Мішенями виконавчих каспаз є численні білки, значна частина яких локалізується в ядрі. Розщеплення молекул-мішеней визначає весь спектр проявів апоптозу. Одна з головних мішеней каспази 3 - эндонуклеаза CAD (Caspase-activated DNase) активується внаслідок розщеплення інгібіторного субкомпоненту. Активована CAD здійснює деградацію ДНК, діючи на доступні для неї ділянки молекули, розташовані між нуклеосомами. Розщеплення тієї ж каспазою ядерних ферментів PARP(Poly-ADP-Ribose Polymerase), а також ДНК-залежної протеїнкінази блокує процес репарації ДНК. Дія каспаз на фактор ретинобластоми (Rb) і d-ізоформу протеїнкінази визначає порушення контролю клітинного циклу. Розщеплення кіназ МNK-1 і FAK призводить до змін, що мають наслідком ослаблення адгезійної здатності клітини, а розщеплення гельсоліну та кінази РАК визначає характерні зміни клітинної морфології.

Вже згадувалося, що клітини, які піддаються апоптозу, швидко фагоцитують. Цьому сприяє експресія на поверхні апоптотичних клітин ряду молекул, що розпізнаються фагоцитами та полегшують процес фагоцитозу. Так, при апоптозі порушується асиметрія мембрани, і фосфатидилсерін, що в нормі локалізується на внутрішній поверхні мембрани, виявляється експонованим на поверхні. Він розпізнається молекулою CD14 макрофагу та, можливо, іншими Рц. Вільні залишки Сахаров, що формуються внаслідок десіалювання мембранних глікокон'югатів, розпізнаються мембранними лектинами фагоцитів. Тромбоспондин, який також з'являється на поверхні апоптотичних клітин, впізнається молекулами адгезії - інтегрином a 2 b 2 і CD36, через які сигнали передаються всередину клітини фагоциту і активують її метаболізм. Лізосомальна ДНКаза II довершує деградацію ДНК апоптотичної клітини вже усередині фагоциту. Завдяки швидкому фагоцитозу і відсутності виходу внутрішньоклітинного вмісту в міжклітинний простір, клітина, що гине, не «забруднює» його і не залучає в процес загибелі сусідні клітини, що становить важливу відмінність апоптозу від некрозу.

У зв'язку з інтенсивним фагоцитозом апоптотичних клітин їх важко визначити in situ. Ідентифікація процесу апоптозу не обмежується реєстрацією морфологічних змін клітин (це надто суб'єктивний показник). Вона заснована на низці особливостей процесу, про які йшлося вище (рис. 52). Більшість методів визначення апоптозу ґрунтується на виявленні деградації ДНК. Ще недавно як основний і найнадійніший метод визначення апоптозу клітин використовувався електрофорез фрагментів ДНК, екстрагованих з клітини: для апоптозу характерна «драбинка», тобто наявність фрагментів, за протяжністю кратних довжині ДНК в нуклеосомі, що при електрофорезі проявляється у вигляді дискретних фракцій. Для виявлення нерепарованих розривів ДНК використовують TUNEL-метод (TdT-mediated dUTR-biotin Nick End Labeling), заснований на каталізованому термінальною дезоксинуклеотидилтрансферазою (TdT) приєднанні до вільного 3"-кінця нитки ДНК мічених нуклеістоцитів з подальшим виявленням мечів. Як скринінг-метод використовують цитофлуорометричне виявлення гіподиплоїдних клітин (тобто клітин, що втратили частину ДНК внаслідок її деградації), за допомогою фарбування пропідію йодидом Ще один широко поширений цитофлуорометричний метод визначення апоптозу використовується для виявлення експресії клітинами фосфатид V, мічений флуорохромом Комбінування фарбування анексіном і пропідію йодидом дозволяє диференціювати апоптотичні та некротичні клітини (тільки останні фарбуються пропідієм без попередньої фіксації).

Мал. 52 . Методи визначення апоптозу. а - схеми електрофореграм олігонуклеотидів, що ілюструють різні прояви деградації ДНК при апоптозі (ліворуч - «драбинка», що відображає наслідки міжнуклеосомної деградації ДНК з формуванням дискретних фракцій) і некрозі (праворуч - суцільна пляма, що відображає невпорядковану деградацію ДНК), цитофлуорометричному аналізі фіксованих клітин, пофарбованих на ДНК пропідію йодидом Основний пік відповідає диплоїдним клітинам, пік праворуч - клітинам, що знаходяться в клітинному циклі, пік зліва, відзначений курсором М1 - гіподиплоїдним клітинам, що втратили частину ДНК в результаті апоптозу - 28,7% від загального числа, - результати цитофлуорометричного аналізу нефіксованих клітин, пофарбованих кон'югатом анексину V з ізотіоціанатом флуоресцеїну (по осі абсцис) та пропідію йодидом (по осі ординат). Життєздатні клітини присутні у нижньому лівому квадранті. У правому нижньому квадранті містяться клітини, що зазнали апоптозу (зв'язують анексії V, але непроникні для пропідію йодиду), у лівому верхньому квадранті - клітини, що зазнали некрозу (непроникні для пропідію йодиду, не зв'язують анексії клітини, що зазнали апоптозу, який перейшов у некроз.

1) Рецепторні. Здійснюється за допомогою «рецепторів смерті» при взаємодії, що активує, з відповідними лігандами, більшість з яких відноситься до суперсімейства фактора некрозу пухлин. Взаємодія рецептора з лігандом призводить до активації адапторних білків, асоційованих з «доменами смерті» (FADD - Fas-associated death domain, TRADD - TNF-R-associated death domain) і прокаспази 8, продукт якої - каспаза 8 (ініціаторна) активує каспазу 3 (ефекторну), що, у свою чергу, обумовлює активацію ендонуклеаз, що фрагментують ДНК.

2) Мітохондріальний. Участь мітохондрій в апоптозі забезпечується присутністю в їх матриксі та міжмембранному просторі великої кількості біологічно активних речовин (цитохрому С (Cyt С); прокаспаз 2, 3, 9; апоптозиндуцірующего фактора (AIF), що мають виражену апоптогенну дію. в цитоплазму при зниженні трансмембранного потенціалу мітохондрій внаслідок відкриття гігантських мітохондріальних пір (виконують роль Ca 2 +-, рН-, потенціал-, НАДФ2Н/НАДФ+- і редоксзалежних каналів) і підвищення проникності мітохондріальних мембран. , НАДФН, АТФ та АДФ, утворення активних форм кисню, роз'єднання окислювального фосфорилювання, збільшення вмісту Ca 2 + у цитоплазмі.Надходження міжмембранних білків та активація апоптозу можливі також при розриві зовнішньої мембрани мітохондрій внаслідок гіперполяризації внутрішньої мембрани.

3) р53-опосередкований. p53 - багатофункціональний білок, що відіграє важливу роль у моніторингу сигналів про стан клітини, цілісність її геному, активність систем ДНК-репарації. Пошкодження ДНК призводить до накопичення білка р53 у клітині. Це визначає зупинку клітинного циклу у фазах G 1 і G 2 , запобігає реплікації, активує синтез та репарацію ДНК, а отже, створює умови для відновлення нативної структури ДНК, перешкоджає появі мутантних та анеуплоїдних клітин в організмі. Якщо є недостатність систем ДНК-репарації та пошкодження ДНК зберігаються, клітина піддається апоптозу. Зокрема, білок р53 здатний індукувати транскрипцію таких апоптогенних факторів, як Bax, Fas-рецептор, DR-5 та ін.

4) Перфорин-гранзимовий. Цитотоксичні Т-лімфоцити (Т-кілери) викликають апоптоз клітин-мішеней (наприклад, інфікованих клітин) за допомогою перфоринового білка. Полімеризуючись, перфорин утворює в цитоплазматичній мембрані клітинімішені трансмембранні канали, якими всередину клітини надходять секретовані Т-кілером гранзими (фрагментини) - суміш серинових протеаз. Основним компонентом цієї суміші є гранзим - протеолітичний фермент, що активує каспазу 3.

Значення білків-регуляторів апоптозу у розвитку організму та патологічних процесах

Вcl-2потрібно для підтримки життєздатності лімфоцитів, меланоцитів, епітелію кишечника та клітин нирок під час розвитку ембріона.

Вcl-xнеобхідний для пригнічення смерті клітин в ембріогенезі, особливо в нервовій системі.

Baxнеобхідний для апоптозу тимоцитів та підтримки життєздатності сперматозоїдів під час їх розвитку.

р53є геном супресії пухлин, тому в ембріогенезі особливої ролі не грає, але обов'язково необхідний супресії пухлинного росту.

Посилений синтез білка, що кодується bcl-2 геном, призводить до придушення апоптозу та, відповідно, розвитку пухлин; даний феномен виявлений у клітинах В-клітинної фолікулярної лімфоми.

При лімфопроліферативних захворюваннях і схожій на системний червоний вовчак хвороби у мишей спостерігається порушення функції Fas-ліганду або Fas-рецептора.

Підвищений синтез Fas-лігандапопереджає відторгнення трансплантату.

Апоптоз є частиною патологічного процесу при інфікуванні клітини аденовірусами, бакуловірусами, ВІЛ та вірусами грипу.

Інгібування апоптозу в клітині-хазяїні спостерігається при персистуванні інфекції, в латентному періоді, а при посиленій реплікації аденовірусів, бакуловірусів, можливо герпесвірусів, вірусу Епштейн-Барра та ВІЛ спостерігається активація апоптозу в клітинах імунної системи.

Можливо, буде корисно почитати: