Apoptose. Definition

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Die Hauptaufgabe des Systems, das die Apoptose reguliert, ist- Effektor-Caspasen, die Zellen abbauen, in einem inaktiven Zustand halten, sie jedoch als Reaktion auf eine minimale Wirkung der entsprechenden Induktoren schnell in eine aktive Form umwandeln.

Die Funktion der Aktivierung von Effektor-Caspasen wird von Induktor-Caspasen übernommen, deren Hauptvertreter Caspase 8 und Caspase 9 sind.

Diese Caspasen sind im Normalzustand der Zelle inaktiv und liegen in Form von Procaspasen vor. Daher zielt die Wirkung verschiedener proapoptotischer Signale auf die Aktivierung von Caspase 8 und Caspase 9 ab.

Dementsprechend gibt es zwei Arten von Leitsignalwegen:

1) DNA-Schädigung, Strahlung, Wirkung toxischer Stoffe, Wirkung von Glukokortikoiden, Einstellung der Zytokinregulation, Verkürzung der Telomere auf ein kritisches Maß – Aktivierung von Caspase 9;
2) Proapoptotische Signale, die durch die Aktivierung von Rezeptoren der „Zelltodregion“ (z. B. Fas-R, TNF-R) entstehen – Aktivierung von Caspase 8.

Betrachten wir nacheinander jeden dieser Pfade, schematisch dargestellt in Abb. 1.4.

Signalwege für die Aktivierung von Caspase 9

Das P53-Gen ist ein Sensor für DNA-Schäden und Störungen im Zellzyklus.

P53-Gen

Das P53-Gen, das sich auf dem kurzen Arm von Chromosom 17 befindet, kodiert für die Bildung eines Kernproteins, das aus 393 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 53 Kd besteht. Das P53-Tetramer fungiert als Transkriptionsfaktor und bindet mit seinem Carboxylterminus an bestimmte Regionen von Zielgenen. Das P53-Protein befindet sich im Zytoplasma in einem latenten Zustand.

In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass seine Aktivierung nicht nur als Reaktion auf DNA-Schäden erfolgt, sondern auch eine Folge vieler anderer Prozesse in der Zelle sein kann, einschließlich der Aktivierung von Onkogenen, Hypoxie, Nährstoffmangel, Alterung und anderen. Nicht umsonst wurde dieses Gen von manchen Autoren als „Herr Nachtwächter“ und von anderen als „Wächter des Genoms“ bezeichnet.

Bei Aktivierung von P53 ist das Protein in der Lage, zwei Programme unabhängig voneinander zu starten:

Vorübergehender Stillstand des Zellzyklus in der G1/S-Phase durch das Protein p21 WAF1, das Cyclin-abhängige Kinasen hemmt
Stimulierung der Apoptose durch Aktivierung des Bax-Gens – ein proapoptotisches Gen der Bcl-2-Familie und/oder Aktivierung der Bildung freier Sauerstoffformen, wodurch die Freisetzung von Cytochrom-C aus Mitochondrien gefördert wird.

Experimentelle Daten zur Gen-Abschaltung, die in den letzten Jahren aufgetaucht sind, deuten darauf hin, dass das vorrangige Programm für die meisten Zellen darin besteht, den Mitosezyklus vorübergehend zu stoppen. Es gibt auch Informationen über die Beteiligung von P53 an DNA-Reparaturprozessen durch Aktivierung des neu entdeckten P53R2-Gens, das für die Ribonukleotidreduktase kodiert. Das Apoptoseprogramm wird aktiviert, wenn die Zelle während eines „Stillstands“ während des Mitosezyklus und/oder eines Mangels an p21 WAF1-Protein nicht in der Lage ist, DNA zu reparieren. In einigen Zellen ist die Priorität des Apoptoseprogramms bei der Aktivierung des P53-Gens genetisch bestimmt.

Die Rolle von P53 ist gewebeabhängig. Bei Mäusen, die dieses Gen ausschalteten, löste die Strahlung keine Apoptose in den Lymphozyten aus, im Lungengewebe waren die Anzeichen einer Apoptose jedoch deutlich ausgeprägt.

Abbildung 1.4. Die Hauptwege der Apoptose. Wah, Bid – Familie der proapoptotischen GeneВсl-2. dATP – Adenosintriphosphorsäure. APAF-1 – apoptotischer Protease-aktivierender Faktor

Die Abbildung zeigt die Hauptwege der Apoptose, die zwei Haupttypen proapoptotischer Signale umsetzen: DNA-Schädigung durch Strahlung oder zytotoxische Wirkstoffe und Aktivierung von Rezeptoren der „Zelltodregion“.

DNA-Schäden führen zur Aktivierung des P53-Gens. Die weitere Weiterleitung dieser Art von apototischem Signal erfolgt durch die Aktivierung proapoptotischer Gene der Bcl-2-Familie (Bax und Bid). Die Proteine dieser Gene bewirken eine Permeabilisierung der Mitochondrienmembran und die Freisetzung von Cytochrom C in das Zytosol. Adenosintriphosphorsäure (dATP), Apoptose-induzierender Faktor (Aif) und DNase. Cytochrom C aktiviert zusammen mit dATP das im Zytosol befindliche APAF-1-Protein und bildet ein Apoptosom, in dem Caspase-9 aktiviert wird. Letzteres aktiviert Caspase-3, den wichtigsten „Ausführer“ der Caspase-Kaskade.

Anschließend werden andere Caspasen, Proteasen und DNasen aktiviert und es kommt zur Apoptose. Aus Mitochondrien freigesetztes Aif und DNase führen einen zusätzlichen Extra-Caspase-Weg der Apoptose durch und realisieren ihre Aktivität direkt im Zellkern.

Die Bindung der „Zelltodregion“-Rezeptoren mit den entsprechenden Liganden führt zur Aktivierung von Caspase 8, die zur unabhängigen Aktivierung von Caspase 3 fähig ist. Auf diesem Weg kann eine zusätzliche Beteiligung der Bcl-2-Genfamilie durch die Aktivierung von erfolgen Bid-Genproteine durch Caspase 8.

Dennoch sollte die Hauptfunktion des P53-Gens in der Aktivierung des Apoptoseprogramms bei einer Schädigung des zellulären Genoms gesehen werden, was als Schutzreaktion des Körpers gegen die Ansammlung genetisch defekter Zellen angesehen werden kann. Eine Abnahme der Aktivität des P53-Gens oder eine Mutation darin, die zum Verlust der Fähigkeit zur Apoptoseauslösung führt, ist ein schwerwiegender Faktor, der das Auftreten von Tumoren und die Entwicklung einer Resistenz gegen Chemotherapie prädisponiert.

Die Mutation des P53-Gens kommt bei mehr als der Hälfte der Krebserkrankungen vor und ihre Häufigkeit nimmt mit einer langfristigen Chemotherapie zu. Bei Kindern wird bei T-ALL häufiger eine Mutation im P53-Gen beobachtet, die etwa 12 % ausmacht und stets einen ungünstigen Prognosefaktor darstellt.

Das P53-Gen ist also für die Umsetzung des Apoptoseprogramms bei DNA-Schäden und toxischen Wirkungen auf die Zelle notwendig. Wie im Diagramm (Abb. 4) zu sehen ist, ist der nächste Schritt bei der Weiterleitung eines proapoptotischen Signals entlang dieses Signalwegs die Einbeziehung der Bcl-2-Genfamilie.

Bcl-2-Genfamilie

Das Interesse an Apoptose nahm Mitte der 80er Jahre stark zu, als entdeckt wurde, dass eine erhöhte Aktivität des Bcl-2-Onkogens, die eine Folge der beim menschlichen follikulären B-Zell-Lymphom häufigen t(14;18)-Translokation ist, zur Apoptose führt Die Bildung eines Tumorklons ist nicht auf eine erhöhte Proliferation, sondern auf ein erhöhtes Überleben der Tumorzellen zurückzuführen.

Später wurde gezeigt, dass während dieser Translokation das Bcl-2-Onkogen, das ursprünglich auf dem Chromosomensegment 18q21 lokalisiert war, mit dem Locus fusioniert, der für die schwere Ig-Kette auf Chromosom 14q32 kodiert, was zu seiner erhöhten Expression führt. Molekulargenetische Studien des nächsten Jahrzehnts zeigten, dass die sogenannte Familie der Bcl-2-Gene, die beim Menschen auf Chromosom 18 abgebildet sind, auch andere Gene umfasst, die Proteine mit entgegengesetzter Funktion exprimieren (siehe Tabelle 1.1).

Tabelle 1.1. FamilienzusammensetzungВсl-2Gene

* bezeichnet die Anzahl der konservierten Sequenzen, die als Bcl-2-homologe Regionen bekannt sind. **** – 4 Regionen (VN1–VN4); *** - 3 Regionen (VN1-VNZ); ** - 2 Regionen (VNZ, VN4); * - 1 Region (VNZ); COOH-terminale hydrophobe Domäne, die für die Anlagerung von Proteinen an die äußere Schicht der Mitochondrienmembran verantwortlich ist.

Derzeit wurden die 16 Gene, aus denen diese Familie besteht, geklont. Von diesen Genen abgeleitete Proteine weisen eine ähnliche morphologische Zusammensetzung auf – jedes von ihnen weist mindestens eine der vier konservierten Aminosäuresequenzen auf, die für das Bcl-2-Gen charakteristisch sind. Diese Sequenzen werden als zu Bcl-2 homologe Regionen (BH1–BH4) bezeichnet. Die funktionelle Bedeutung dieser Regionen ist nicht ganz klar, aber einigen Forschern zufolge sorgen sie für die reaktiven Fähigkeiten der Proteine dieser Familie.

Wie folgt aus den in Tabelle 1.1 dargestellten. Daten, nur 6 von ihnen sind, wie der Gründer dieser Familie - Bcl-2-Gen, anti-apoptotische Wirkung: Schützt Zellen vor einer Vielzahl physiologischer und experimenteller Einflüsse, die auf die Auslösung der Apoptose abzielen. Zu diesen Reizen gehören DNA-Schäden, die Wirkung von Glukokortikoiden, die Einstellung der Zytokinregulation usw. Einige der Proteine in dieser Gruppe verfügen über eine COOH-terminale hydrophobe Region, die für die Bindung von Proteinen an die äußere Oberfläche der Mitochondrienmembran verantwortlich ist.

Die verbleibenden 10 Mitglieder der Bcl-2-Familie verursachen Apoptose. Diese proapoptotischen Proteine können abhängig von der Anzahl ihrer VL-Regionen in zwei Untergruppen unterteilt werden. Die ersten 4 (siehe Tabelle 1.1.) haben 2-3 VN-Regionen, während die restlichen 6 nur eine VZ-Region haben. Mit dieser Region ist die proapoptotische Funktion von Proteinen verbunden. Viele der proapoptotischen Proteine, wie auch die antiapoptotischen Proteine dieser Familie, haben eine terminale hydrophobe Domäne, aber im Gegensatz zu letzteren heften sie sich nicht an das Mitochondrium, bevor sie ein proapoptotisches Signal empfangen.

Die Wahrnehmung anti- oder proapoptotischer Signale durch Mitglieder der Bcl-2-Familie erfolgt sowohl auf Genebene (z. B. erhöht das P53-Protein die Expression des Bax-Gens) als auch auf der Ebene posttranskriptioneller Proteine (die Wirkung von Zytokine). Gleichzeitig werden komplexe Wechselwirkungen zwischen den Proteinen selbst beobachtet, teilweise in antagonistischer Weise. Bei diesen Wechselwirkungen können pro- und anti-apoptotische Proteine sowohl innerhalb ihrer eigenen Gruppe als auch mit Proteinen entgegengesetzter Wirkrichtung Homo- und Heterodimere bilden (siehe Abb. 1.5). Einige Verbindungen zwischen Promotoren und Suppressoren des Zelltods sind hochspezifisch (z. B. Bok und Mc1-1), andere sind eher zufällig.

Abbildung 1.5. Interaktionsmodi zwischen FamilienproteinenВсl-2

Die Bedeutung dieser Wechselwirkungen konnte bisher nur in Bezug auf proapoptotische Proteine geklärt werden, die über eine B3-Domäne verfügen. Diese Proteine können ihre proapoptotische Aktivität nur auf antagonistische Weise entfalten und bilden Heterodimere mit antiapoptotischen Proteinen der Bcl-2-Familie. Diese Regel gilt nicht für alle Familienmitglieder; Bcl-xL erfordert beispielsweise keine Bindung an den Zelltod-Promotor, um seine antiapoptotische Aktivität auszudrücken.

Abbildung 1.6. Veranlagung zur Apoptose. Das Verhältnis der Anzahl von Homodimeren zu Heterodimeren bestimmt die Anfälligkeit für Apoptose

Als Ergebnis zahlreicher bisheriger Experimente scheint es, dass die Entscheidung über Leben oder Tod einer Zelle auf der Ebene der Bcl-2-Familie getroffen wird, basierend auf der relativen Dominanz aktiver Suppressoren oder Promotoren der Apoptose. Diese Situation ist in Abb. schematisch dargestellt. 1.6.

Wie wird diese Entscheidung umgesetzt, was ist für weitere Fortschritte auf dem Signalweg notwendig, dessen Endpunkt die Aktivierung des Induktors Caspase 9 sein soll?

Die pro- und anti-apoptotischen Wirkungen aktivierter Proteine der Bcl-2-Familie werden hauptsächlich durch die Modulation der mitochondrialen Aktivität realisiert.

Die Rolle der Mitochondrien bei den Prozessen des apoptotischen Zelltods

Mitochondrien- eine Matrix, die aus Zellorganellen besteht und von einer zweischichtigen Membran umgeben ist. Das Mitochondrium enthält ein Genom, das in der Lage ist, eine begrenzte Anzahl von RNAs und Proteinen zu kodieren, die für seine Funktion notwendig sind. Die meisten Bestandteile des Mitochondriums werden jedoch im Zellkern kodiert und dann in diesen importiert. Die Rolle der Mitochondrien bei der Erhaltung des Lebens ist groß – sie sind die Hauptquelle der zellulären Energie und bilden durch oxidative Phosphorylierung ATP aus ADP. Gleichzeitig halten viele Forscher Mitochondrien für eine Schlüsselrolle bei der Apoptose.

Dies liegt daran, dass Mitochondrien eine Quelle für Cytochrom C, ATP, Ca++ sind. AIF (Apoptose-induzierender Faktor)- Komponenten, die für die weitere Förderung des apoptotischen Signals notwendig sind. Die Freisetzung dieser Faktoren aus dem Mitochondrium erfolgt nur, wenn seine Membran mit aktivierten Proteinen der Bcl-2-Familie interagiert. Vieles in diesem Prozess bedarf der Klärung, lässt sich aber schematisch wie folgt darstellen. Aktivierte Proteine der Bcl-2-Familie werden mit ihren COOH-hydrophoben Basen wie Anker an der Außenmembran der Mitochondrien befestigt.

Dies geschieht an Stellen, an denen die äußere und innere Membran zusammentreffen, wo offenbar physiologisch Permeabilisierungsporen, sogenannte Megakanäle, mit einem Durchmesser von nicht mehr als 2 nm vorhanden sind. Diese Poren fungieren als Sensoren für viele physiologische Parameter und vermitteln so Informationen über die wichtigsten Stoffwechselvorgänge in der Zelle. Sie sind Kanäle für Ca2+, Spannung, pH-Wert und aktive Formen von O2, lassen jedoch einige Anionen nicht durch und sind für größere Moleküle von Cytochrom C, ATP und Aif, die für die Apoptose notwendig sind, undurchdringlich.

Es wurde gezeigt, dass proapoptotische Proteine der Bcl-2-Familie (Bax, Bad, Bak usw.), die in der Außenmembran verwurzelt sind, sich mit ANT (Adenin-Nukleotid-Translokator) verbinden, die an diesen Orten in die Innenmembran eingebaut sind, und bilden vorübergehend größere Megakanäle (Durchmesser 2,4-3 nm). Über diese Kanäle gelangen Cytochrom C, ATP und der Apoptose-induzierende Faktor in das Zytosol der Zelle. Anti-apoptotische Proteine der Bcl-2-Familie sind nicht in der Lage, die Mitochondrienmembran zu permeabilisieren. Berichten zufolge schließen sie im Gegenteil bestehende Kanäle, unterbrechen so das Fortschreiten des pro-apoptotischen Signals und schützen die Zelle vor Apoptose . Welchen Zweck haben proapoptotische mitochondriale Signalmoleküle?

Cytochrom-C- ein Protein mit einem Molekulargewicht von 15 kDa, das vom Kerngenom kodiert wird, als Apocytochrom C synthetisiert, in das Mitochondrium importiert wird, wo es sich an der Innenfläche der Membran anheftet und über Megakanäle, die ihm von proapoptotischen Proteinen geöffnet werden, in das Zytosol austritt der Bcl-2-Familie (Bax, Bad, Bak usw.). Cytochrom-C ist für die Bildung des Apoptosoms notwendig, bei dem Caspase 9 aktiviert wird, das dann wiederum die Haupt-„Killer“-Caspase 3 aktiviert (siehe Abb. 1.4). Dadurch wird der durch DNA-Schäden verursachte apoptotische Signalweg beendet.

Das Apoptosom ist ein Komplex aus APAF-1 (apoptotischer Protease-Aktivierungsfaktor), Cytochrom-C, Caspase-9 und ATP. Vor der Kombination mit Cytochrom C liegt APAF-1 im Zytosol in einem inaktiven Zustand vor. Fehlt eine ausreichende Menge ATP, findet keine Apoptosomenbildung statt und der Zelltod verläuft nekrotisch.

Zusammen mit Cytochrom-C und ATP gelangt auch AIF (Apoptose-induzierender Faktor) aus den Mitochondrien in das Zytosol der Zelle. Auch die Synthese dieses Faktors wird durch das Kerngenom kodiert; die Umwandlung in die reife Form (ein Protein mit einem Molekulargewicht von 75 kDa) erfolgt in den Mitochondrien. Nach dem Verlassen des Mitochondriums wandert AIF zum Zellkern, wo es eine DNA-Fragmentierung verursacht, die an Apoptose erinnert. Die Überexpression von Bcl-2 verhindert die Freisetzung des Apoptose-induzierenden Faktors aus den Mitochondrien, nicht jedoch dessen Aktivität, wenn im Experiment AIF in die Zelle eingeführt wird. AIF erfordert keine zytosolische Aktivierung, wird vom Mitochondrium an Cytochrom-C abgegeben und trägt möglicherweise zu dessen Freisetzung bei. Somit ist der Apoptose-induzierende Faktor ein unabhängiger „Killer“-Faktor, der die Wirkung von Cytochrom-C und Caspasen dupliziert, wenn sie blockiert sind.

Interessanterweise verlieren die Mitochondrien während des Apoptoseprozesses nicht ihre Integrität und werden nicht zerstört.

Die hier aufgeführten Ereignisse bilden die Grundlage für die Hypothese, dass das Mitochondrium eine Schlüsselrolle bei der Apoptose zu spielen scheint. Es gibt jedoch eine alternative Hypothese, die die Kaskadenaktivierung von Caspasen als Hauptmotor der Apoptose ansieht, während das aus Mitochondrien freigesetzte Cytochrom C kein Initiator, sondern nur ein Verstärker der apoptotischen Kaskade ist. Die neuesten Ideen werden durch Daten gestützt, die belegen, dass die Aktivität der Bcl-2-Familie ohne die Beteiligung von Mitochondrien unterstützt werden kann. Es wurde gezeigt, dass anti-apoptotische Proteine dieser Familie mit APAF-1 im Zytosol einen Komplex bilden und dessen Aktivität blockieren können. Die Hemmung dieser Assoziation durch Mitglieder der proapoptotischen Bcl-2-Familie setzt APAF-1 frei und ermöglicht die Aktivierung von Caspase 9.

Caspase-8-Aktivierungssignalweg

Die Übertragung eines proapoptotischen Signals, wenn ein Ligand an die Rezeptoren der Zelltodregion bindet, erfolgt über die Adapterproteine FADD/MORT1, deren N-terminale Region (DED) wiederum an eine ähnliche Region von Procaspase-8 bindet, was dazu führt seine autokatalytische Aktivierung (siehe Abb. 1.4 und Abb. 1.7). Wenn einige Mitglieder der TNF-Rezeptorfamilie (einschließlich TNF-R1) aktiviert werden, wird ein zusätzliches Adapterprotein, TRADD, verwendet.

Abbildung 1.7. Durch das Signal der Zelltodregion induzierte Apoptose. FADD-fas-assoziierte Todesdomäne (FAS-assoziierte Zelltodregion); TRADD-TNF-assoziierte Todesdomäne (cTNF-R-assoziierte Zelltodregion); DD – Todesdomäne (Todesregion); DED – Todeseffektordomäne (Region des Todesvollstreckers); NF-kB, AP-1 – Transkriptionsfaktoren, die entzündungsfördernde und immunmodulatorische Gene aktivieren

Der Rezeptorweg des Zelltods scheint kürzer zu sein als die durch DNA-Schäden ausgelöste und oben diskutierte apoptotische Kaskade: Caspase 8 wird durch Adaptermoleküle aktiviert, die wiederum Henker-Caspasen direkt aktivieren können. Dies ist jedoch nur das Grundschema; in Wirklichkeit ist dieser Signalweg viel komplexer und mit anderen Mechanismen der Apoptose verknüpft. Somit ist bekannt, dass Caspase 8 in der Lage ist, das Bid-Protein zu aktivieren, was, wie oben ausführlich beschrieben, zur Freisetzung von Cytochrom C aus Mitochondrien führt. Obwohl klar ist, dass dieser Weg keine Aktivierung von Mitochondrien erfordert, verstärkt ihre Beteiligung an dem Prozess die rezeptorinduzierte Apoptose (siehe Abb. 1.4).

Der gleiche Signalweg wird unter Beteiligung weiterer Adapterproteine auch zur Umsetzung anderer zellulärer Programme genutzt. Somit kann das Signal, das TNF-R1 passiert, auch die Transkriptionsfaktoren NF-kB und AP-1 aktivieren. Diese Signalmoleküle bewirken die Aktivierung von Genen, die Entzündungsfaktoren produzieren. Wenn TNF-R aktiviert wird, muss die Zelle daher eine Entscheidung treffen, ob sie Selbstmord begeht oder überlebt, um proinflammatorische Zytokine zu produzieren.

Letztere Entscheidung wird häufiger von Lymphozyten getroffen, möglicherweise weil der Transkriptionsfaktor NF-kB apoptotische Wege hemmt. Die Wahl der Zelle wird offenbar auch von der Zellgemeinschaft beeinflusst. Dieses Beispiel bestätigt, dass die gleichen Signalwege zur Umsetzung verschiedener zellulärer Programme verwendet werden; die Mechanismen der Auswahl und Entscheidungsfindung bleiben weitgehend unklar. Somit ist der Rezeptorweg des Zelltods in Lymphozyten unabhängig von der Bcl-2-Genfamilie und kann nicht durch deren antiapoptotische Aktivität unterdrückt werden.

Die Aktivierung von P53 kann in einigen Zellsystemen zur Transaktivierung von Genen führen, die Rezeptoren der „Zelltod“-Region kodieren.

Daher gibt es je nach Zelltyp und Spezifität des proapoptotischen Signals unterschiedliche, oft überlappende Wege und Mechanismen zur Umsetzung des apoptotischen Programms. Die Diversität und Multivarianz der Apoptose-Signalwege verschaffen der Zelle freie Kapazitäten zur Durchführung eines für die Zelle so wichtigen Programms und machen dieses Programm gleichzeitig sehr abhängig von vielen äußeren und inneren Einflüssen.

E.B. Wladimirskaja

Die Entwicklung der Apoptose kann in drei Phasen unterteilt werden. Das Wesentliche der ersten davon ist der Signalempfang und die Anfangsstadien seiner Übertragung; Diese Phase ist reversibel. Die zweite Phase, die Aktivierung von Caspasen, ist ein Schlüsselereignis bei der Entwicklung der Apoptose; es führt zu irreversiblen Folgen. Die dritte Phase besteht aus der Umsetzung des Zelltods, der in der vorherigen Phase programmiert wurde. Die Manifestationen der ersten Phase der Apoptoseentwicklung sind vielfältig. Die zweite und dritte Phase verlaufen standardisierter. Nach modernen Konzepten werden die Wege und Mechanismen zur Auslösung der Apoptose auf zwei Mechanismen reduziert – Rezeptor und Mitochondrien, die in Abbildung 51 schematisch dargestellt sind.

Der Rezeptormechanismus zur Auslösung der Apoptose wurde am ausführlichsten untersucht. Spezialisierte RCs können auf der Zelloberfläche exprimiert werden und Signale für die Entwicklung der Apoptose übertragen. Ihre allgemeine Bezeichnung lautet „Todesrezeptoren“ (DR). Diese RCs gehören zur RC-Familie der Tumornekrosefaktoren (TNF). Sie unterscheiden sich von anderen RCs dieser Gruppe durch das Vorhandensein einer speziellen „Todesdomäne“ (DD) im zytoplasmatischen Teil, die notwendig ist, um das intrazelluläre Signal einzuschalten, das zur Entwicklung der Apoptose führt. Bisher wurden 6 DR-Rc beschrieben. Unter ihnen ist Fas-Rc (APO-1, CD95) das bekannteste. Sein Ligand ist ein trimeres Molekül, das zur TNF-Familie gehört – Fas-Ligand (FasL, CD178). Es sind membranöse und lösliche Formen von FasL bekannt, von denen die erste ein wesentlich wirksamerer Auslöser der Apoptose von Zellen des CD95-Phänotyps ist als die zweite. Zur DR-Familie gehört auch TNF-R1 – TNF-PCR vom Typ 1 (p55, CD120A), während der PCR vom Typ 2 (p75, CD120B) eine „Todesdomäne“ fehlt und apoptogene Signale nicht direkt enthalten sind. Die Liganden für TNF-R1 sind Moleküle der TNF-Familie – TNF a und Lymphotoxin a (TNF b). Der DR3 rc überträgt Signale von einem untercharakterisierten DR3L-Molekül (APO3-L). DR4 und DR5 dienen als RCs für das TRAIL-Molekül. Dieses ebenfalls zur TNF-Familie gehörende Trimer bindet auch an die PCR-Fallen DcR1 und DcR2, die die Zerstörung von TRAIL bewirken. In dieser Hinsicht spielt TRAIL keine wesentliche Rolle bei der Induktion der Apoptose normaler Zellen, induziert jedoch die Apoptose von Tumorzellen, in denen RC-Fallen fehlen oder nur schwach exprimiert werden. Die Natur des DR6-Liganden ist noch nicht geklärt.

In allen Fällen führt die Wechselwirkung trimerer Liganden mit RC zu deren Trimerisierung, was eine Voraussetzung für ihre Funktion als Überträger apoptotischer Signale ist. In diesem Fall erwerben die Todesdomänen die Fähigkeit, mit ähnlichen Domänen der Adapterproteine FADD (Fas-assoziierte Todesdomäne) und TRADD (TNF-Rezeptor-Todesdomäne) zu interagieren. FADD erkennt die Todesdomänen in Procaspase 8 und bewirkt durch Interaktion mit ihnen die Aktivierung von Caspase 8. Das Ergebnis von TRADD ist ähnlich, wird jedoch durch FADD realisiert. Die durch diese Wechselwirkungen entstehenden Molekülkomplexe werden DISC (Death–inducing signaling complex) genannt. Der Rezeptorweg zur Ermöglichung der Apoptose erfordert keine RNA- und Proteinsynthese de novo. Da Apoptose durch eine aktive Wirkung auf zelluläre RCs ausgelöst wird, wird sie als aktive Apoptose bezeichnet.

Eine weitere Gruppe von Mechanismen zur Auslösung der Apoptose wird unter Bedingungen eines Mangels an Wachstumsfaktoren realisiert, wenn die Zelle sozusagen sich selbst überlassen wird (Apoptose „standardmäßig“ – Abb. 51). Diese Form der Apoptose wird auch passive Apoptose genannt. Der Mechanismus der passiven Apoptose wird beim Zelltod unter dem Einfluss von Stressfaktoren (einschließlich Strahlung), Glukokortikoiden und einer Reihe toxischer Wirkstoffe, beispielsweise Zytostatika, die in der onkologischen Praxis eingesetzt werden, genutzt. In diesen Fällen sind die Prozesse, die in den Mitochondrien in Gang gesetzt werden und auf eine Erhöhung der Durchlässigkeit ihrer Membran für proapoptotische Faktoren zurückzuführen sind, die Grundlage der Apoptose.

Reis. 51 . Entwicklung der Apoptose: Es werden zwei Mechanismen zum Einschalten der Apoptose gezeigt – verursacht durch eine Erhöhung der Mitochondrienpermeabilität (Apoptose „standardmäßig“) und des Rezeptors („Aktivierung“). Beide Mechanismen führen zur Umsetzung der Apoptose nach einem einzigen Effektormechanismus. TRAIL ist ein Ligand, der die mit dem Tumornekrosefaktor verbundene Apoptose induziert. FasL – Ligand für РсFas (vom Fas-Liganden); TNFRI – RC für Tumornekrosefaktor I (vom TNF-Rezeptor I); DR – RC des „Todes“ (von – Todesrezeptor); FADD – „Todes“-Domäne von RC Fas (aus der Fas-assoziierten Todesdomäne); TRADD – „Todes“-Domäne von RC für Tumornekrosefaktor (aus der TNF-Rezeptor-assoziierten Todesdomäne). Neben den Symbolen, die die Faktoren symbolisieren, sind deren Namen angegeben. Durchgezogene Pfeile bedeuten Transformationen, gepunktete Pfeile bedeuten Einflüsse, gestrichelte Pfeile bedeuten Bewegungen von Faktoren. Erläuterungen im Text.

Viele Zellen (vielleicht die meisten) benötigen spezielle Signale, um ihre Lebensfähigkeit aufrechtzuerhalten. Die Quelle solcher Überlebenssignale sind normalerweise Zytokine und Kontaktinteraktionen mit umgebenden Zellen. Fehlen Überlebenssignale in der Zelle, ist die Mitochondrienfunktion beeinträchtigt, insbesondere die Mechanismen der Glykolyse und der ATP-Dephosphorylierung. Da ADP und das glykolytische Produkt Pyruvat für die normale Durchführung der oxidativen Phosphorylierung, des Elektronentransports und der Bildung eines Protonengradienten notwendig sind, werden diese Prozesse gestört, was zu einer Schädigung der Mitochondrienmembran führt.

Parallel dazu wird ein Mechanismus ausgelöst, der durch Proteine realisiert wird – Produkte von Protoonkogenen der Bc1–2-Familie. Diese Proteine werden in mehrere Gruppen eingeteilt. Einige Proteine enthalten 3–4 BH-Domänen (BH – aus der Bcl-2-Homologie) und werden in anti-apoptotische (Bcl-2, Bcl-X L, Mcl-1 usw.) und pro-apoptotische (Bax, Bak, Bcl–X S usw.) Faktoren. Eine besondere Gruppe besteht aus „BH3-only“-Proteinen („BH3-only“ – Bad, Bid, Bik, Bim, Noxa, Bbc3 usw.), die dem Namen entsprechend nur eine BH-Domäne enthalten – BH3. und in anderer Hinsicht unterscheiden sie sich von den Proteinen der betrachteten Familie. Es sind „nur BH3“-Proteine, vor allem Bim, die aus dem Zytoskelett mobilisiert werden und denen die Rolle der Standardauslöser der Apoptose zugeschrieben wird. Die Expression oder Aktivierung von „nur BH3“-Proteinen erfolgt unter Bedingungen eines Mangels an Zytokinen und anderen Überlebensfaktoren sowie während der Aktivierung des p53-Proteins, das ein Sensor für DNA-Brüche ist (im letzteren Fall „nur BH3“) die Faktoren Noxa und Bbc3 werden aktiviert). „Nur-BH3“-Proteine blockieren antiapoptotische Faktoren wie Bcl-2, bilden mit ihnen Dimere und fördern die Manifestation der Aktivität proapoptotischer Faktoren. Die wichtigste Manifestation der Aktivität des letzteren ist die Bildung von Transmembranporen, die durch die Oligomerisierung von Bax und Bac entstehen, die normalerweise durch antiapoptotische Faktoren unterdrückt wird.

Durch Poren in der Mitochondrienmembran gelangen Cytochrom C und APAF-1 (Apoptose-Protease-Aktivierungsfaktor 1) in das Zytosol. APAF-1 wird aus der Mitochondrienmembran freigesetzt: Der Bik-Faktor verdrängt es aus dem Heterodimer mit den Faktoren Bc1-2 oder BCL-X L, in dem es in der Membran zurückgehalten wird. APAF-1 und Cytochrom C bilden in Gegenwart von ATP einen Komplex mit einer inaktiven Caspase, Procaspase 9. Dieser Komplex wird Apoptosom genannt. Darin findet unter dem Einfluss von APAF-1, das die homologe Domäne in Procaspase erkennt, eine Caspase-Aktivierung statt 9. Im Gegensatz zum Rezeptormechanismus erfordert die Umsetzung des mitochondrialen Apoptosewegs die Expression einer Reihe von Genen und deren Synthese de novo RNA und Protein.

Vor der Caspase-Aktivierung ist der Prozess der Apoptose reversibel. Die Blockierung der Ausbreitung des apoptotischen Signals entlang der Wundbahnen erfolgt auf unterschiedliche Weise. Der Rezeptormechanismus der Apoptose kann durch die Aktivierung einer Gruppe von Faktoren FLIP (FLICE-inhibitorische Proteine; FLICE – der alte Name für Caspase 8) unterbrochen werden, die die für Caspase 8 charakteristischen Effektor-Todesdomänen enthalten, denen jedoch das katalytische Zentrum fehlt . Dadurch blockieren sie kompetitiv die Wirkung dieser Caspase. Der mitochondriale Mechanismus der Aktivierung der Apoptose wird durch die oben genannten antiapoptotischen Faktoren der Bc1–2-Familie blockiert, hauptsächlich durch Bc1–2 selbst und Bcl–X L. Die Wirkung von Bc1–2 hängt hauptsächlich mit seiner Fähigkeit zusammen, „nur BH3“-Faktoren zu binden und deren stimulierende Wirkung auf die Bildung von Bax-Bak-Komplexen zu verhindern. Bcl-2 ist auch in der Lage, direkt an Bax und Bak sowie an Apaf-1 zu binden. Diese Mechanismen verhindern die Bildung von Transmembranporen in Mitochondrien und/oder die Bildung von Apoptosomen. Erwähnenswert ist auch der „Sphingomyelin-Rheostat“ – ein Mechanismus zur Kontrolle des Gleichgewichts von Proliferation und Apoptose durch Sphingomyelin-Metaboliten, unter denen Ceramid die Rolle eines proapoptotischen Faktors spielt.

Beide Wege der Apoptose führen also zur Aktivierung von Caspasen. Caspasen sind eine Gruppe von Cysteinproteasen, die die Polypeptidbindung nach Asparaginsäureresten spalten. Der Unterschied in der Spezifität zwischen einzelnen Caspasen beruht auf der Erkennung verschiedener Tetrapeptide neben der Bruchstelle mit dem NH 2 -Ende. Der Rezeptorweg führt zur Aktivierung von Caspase 8 (seltener Caspasen 2 und 10), der mitochondriale Weg führt zur Aktivierung von Caspase 9. Diese Enzyme gehören zur Gruppe der Initiator-Caspasen. In ihrer inaktiven Form (Procaspasen) enthalten sie neben zwei Proteasedomänen zwei Todesdomänen (Procaspasen 8 und 10) für die Interaktion mit FADD und anderen Adapterproteinen oder eine Domäne, die Procaspase in das Apoptosom rekrutiert (Procaspase 9 und 2). Ihre Aktivierung ist eine Folge der Aggregation, die durch Interaktion mit Adapterproteinen (FADD, Apaf-1) erfolgt und eine autokatalytische Spaltung der langen N-terminalen Region verursacht. Bei der Aktivierung des Moleküls werden Domänen neu organisiert und es entsteht ein aktives Heterodimer (p18/p11-p18/p11-Tetramer im Fall von Caspase 8, Trimer im Fall von Caspase 9). Nach der Aktivierung der Initiator-Caspasen wird der Prozess der Apoptose irreversibel.

Initiator-Caspasen bewirken eine teilweise Proteolyse (Spaltung einer kurzen Pro-Domäne) und infolgedessen die Aktivierung der ausführenden oder Effektor-Caspasen 3, 6 und 7. Die wichtigste und universellste in ihrer Beteiligung an der Apoptose ist Caspase 3. Aktive Caspase 3 ist ein p17/p12-Dimer. Exekutive Caspasen werden auch unter der Wirkung von Granzym B gebildet, einer Serinprotease, die von Killerlymphozyten (T und NK) zu Zielzellen transportiert wird.

Die Ziele der ausführenden Caspasen sind zahlreiche Proteine, von denen ein erheblicher Teil im Zellkern lokalisiert ist. Die Spaltung von Zielmolekülen bestimmt das gesamte Spektrum der Erscheinungsformen der Apoptose. Eines der Hauptziele von Caspase 3, die Endonuklease CAD (Caspase-aktivierte DNase), wird durch Spaltung der inhibitorischen Unterkomponente aktiviert. Aktiviertes CAD baut DNA ab, indem es auf zugängliche Bereiche des Moleküls einwirkt, die sich zwischen den Nukleosomen befinden. Die Spaltung der Kernenzyme PARP (Poly-ADP-Ribose Polymerase) und der DNA-abhängigen Proteinkinase durch dieselbe Caspase blockiert den DNA-Reparaturprozess. Die Wirkung von Caspasen auf den Retinoblastomfaktor (Rb) und die D-Isoform der Proteinkinase C bestimmt die Störung der Zellzykluskontrolle. Die Spaltung der MNK-1- und FAK-Kinasen führt zu Veränderungen, die zu einer Schwächung der Zelladhäsion führen, und die Spaltung der Gelsolin- und PAK-Kinasen führt zu charakteristischen Veränderungen der Zellmorphologie.

Es wurde bereits erwähnt, dass Zellen, die einer Apoptose unterliegen, schnell phagozytiert werden. Dies wird durch die Expression einer Reihe von Molekülen auf der Oberfläche apoptotischer Zellen erleichtert, die von Phagozyten erkannt werden und den Prozess der Phagozytose erleichtern. Somit wird während der Apoptose die Asymmetrie der Membran gestört und Phosphatidylserin, das normalerweise auf der Innenoberfläche der Membran lokalisiert ist, wird an der Oberfläche freigelegt. Es wird vom Makrophagen-CD14-Molekül und möglicherweise anderen RCs erkannt. Freie Zuckerreste, die bei der Desialylierung von Membranglykokonjugaten entstehen, werden von Membranlektinen von Phagozyten erkannt. Thrombospondin, das auch auf der Oberfläche apoptotischer Zellen vorkommt, wird von Adhäsionsmolekülen erkannt – Integrin a 2 b 2 und CD36, über die Signale innerhalb der phagozytischen Zelle übertragen werden und deren Stoffwechsel aktiviert wird. Die lysosomale DNase II vervollständigt den DNA-Abbau der apoptotischen Zelle bereits im Phagozyten. Aufgrund der schnellen Phagozytose und der fehlenden Freisetzung intrazellulärer Inhalte in den Interzellularraum „kontaminiert“ die sterbende Zelle sie nicht und bezieht benachbarte Zellen nicht in den Absterbeprozess ein, was einen wichtigen Unterschied zwischen Apoptose und Nekrose darstellt.

Aufgrund der intensiven Phagozytose apoptotischer Zellen ist ihre Identifizierung schwierig vor Ort. Die Identifizierung des Apoptoseprozesses beschränkt sich nicht auf die Aufzeichnung morphologischer Veränderungen in Zellen (dies ist ein zu subjektiver Indikator). Es basiert auf einer Reihe der oben diskutierten Prozessmerkmale (Abb. 52). Die meisten Methoden zur Bestimmung der Apoptose basieren auf dem Nachweis des DNA-Abbaus. Bis vor kurzem wurde die Elektrophorese von aus der Zelle extrahierten DNA-Fragmenten als wichtigste und zuverlässigste Methode zur Bestimmung der Zellapoptose verwendet: Apoptose ist durch eine „Leiter“ gekennzeichnet, d. h. das Vorhandensein von Fragmenten, die ein Vielfaches der Länge der DNA betragen im Nukleosom, das während der Elektrophorese in Form diskreter Fraktionen erscheint. Um nicht reparierte DNA-Brüche zu identifizieren, wird die TUNEL-Methode (TdT-mediated dUTR-biotin Nick End Labeling) verwendet, die auf der durch terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT) katalysierten Anheftung markierter Nukleotide an das freie 3"-Ende des DNA-Strangs basiert, gefolgt von Nachweis markierter Zellen durch immunhistochemische oder zytofluorometrische Methoden. Als Screening-Methode wird der zytofluorometrische Nachweis von hypodiploiden Zellen (d. h. Zellen, die aufgrund ihres Abbaus einen Teil der DNA verloren haben) mithilfe von Propidiumiodid-Färbung verwendet... Eine weitere weit verbreitete zytofluorometrische Methode Zur Bestimmung der Apoptose dient der Nachweis der Expression von Phosphatidylserin durch Zellen, das Annexionen mit Fluorochrom-markiertem V binden kann. Die Kombination von Annexin- und Propidiumiodid-Färbung ermöglicht die Differenzierung von apoptotischen und nekrotischen Zellen (nur letztere werden ohne vorherige Fixierung mit Propidium gefärbt). ).

Reis. 52 . Methoden zur Bestimmung der Apoptose. a – Diagramme von Elektropherogrammen von Oligonukleotiden, die verschiedene Manifestationen des DNA-Abbaus während der Apoptose (links – eine „Leiter“, die die Folgen des internukleosomalen DNA-Abbaus mit der Bildung diskreter Fraktionen widerspiegelt) und der Nekrose (rechts – ein fester Fleck) veranschaulichen , was den ungeordneten DNA-Abbau widerspiegelt), b – ein Histogramm, das aus der zytofluorometrischen Analyse fixierter Zellen erhalten wurde, die mit Propidiumiodid auf DNA gefärbt wurden. Der Hauptpeak entspricht diploiden Zellen, der Peak rechts - Zellen im Zellzyklus, der Peak links, markiert mit dem M1-Cursor - hypodiploide Zellen, die durch Apoptose einen Teil ihrer DNA verloren haben - 28,7 % von die Summe, c – Ergebnisse der zytofluorometrischen Analyse von nicht fixierten Zellen, gefärbtes Konjugat von Annexin V mit Fluoresceinisothiocyanat (entlang der Abszissenachse) und Propidiumiodid (entlang der Ordinatenachse). Im unteren linken Quadranten sind lebensfähige Zellen vorhanden. Der untere rechte Quadrant enthält Zellen, die eine Apoptose durchgemacht haben (binden Annex V, sind aber für Propidiumiodid undurchlässig), der linke obere Quadrant enthält Zellen, die eine Nekrose durchgemacht haben (undurchlässig für Propidiumiodid, binden nicht Annex V), der rechte obere Quadrant Es wird angenommen, dass Zellen Apoptose durchlaufen, die in Nekrose übergeht.

1) Rezeptor. Sie erfolgt über „Todesrezeptoren“ durch aktivierende Interaktion mit den entsprechenden Liganden, von denen die meisten zur Superfamilie der Tumornekrosefaktoren gehören. Die Interaktion des Rezeptors mit dem Liganden führt zur Aktivierung von Adapterproteinen, die mit „Todesdomänen“ assoziiert sind (FADD – Fas-assoziierte Todesdomäne, TRADD – TNF-R-assoziierte Todesdomäne) und Procaspase 8, deren Produkt, Caspase 8 (Initiator) aktiviert die Caspase 3 (Effektor), die wiederum die Aktivierung von Endonukleasen bewirkt, die DNA fragmentieren.

2) Mitochondrial. Die Beteiligung der Mitochondrien an der Apoptose wird durch das Vorhandensein einer großen Anzahl biologisch aktiver Substanzen (Cytochrom C (Cyt C); Procaspasen 2, 3, 9; Apoptose-induzierender Faktor (AIF)) in ihrer Matrix und ihrem Intermembranraum sichergestellt eine ausgeprägte apoptogene Wirkung. Der Aktivierungsfaktor für die Apoptose ist die Freisetzung dieser Substanzen in das Zytoplasma mit einer Abnahme des Transmembranpotentials der Mitochondrien aufgrund der Öffnung riesiger Mitochondrienporen (die die Rolle von Ca 2 + -, pH -, Potential spielen). -, NADP2H/NADP + - und redoxabhängige Kanäle) und eine Erhöhung der Permeabilität der Mitochondrienmembranen. Die Öffnung der Poren wird durch den Abbau von reduziertem Glutathion in den Zellen, NADPH, ATP und ADP, Bildung reaktiver Sauerstoffspezies verursacht , Entkopplung der oxidativen Phosphorylierung, Erhöhung des Ca 2 + -Gehalts im Zytoplasma. Der Eintritt von Intermembranproteinen und die Aktivierung der Apoptose sind auch möglich, wenn die äußere Mitochondrienmembran aufgrund einer Hyperpolarisation der inneren Membran reißt.

3) p53-vermittelt. p53 ist ein multifunktionales Protein, das eine wichtige Rolle bei der Überwachung von Signalen über den Zustand der Zelle, die Integrität ihres Genoms und die Aktivität von DNA-Reparatursystemen spielt. DNA-Schäden führen zur Anreicherung des p53-Proteins in der Zelle. Dies führt zum Stillstand des Zellzyklus in den Phasen G 1 und G 2, verhindert die Replikation, aktiviert die DNA-Synthese und -Reparatur und schafft somit Bedingungen für die Wiederherstellung der nativen DNA-Struktur und verhindert das Auftreten mutierter und aneuploider Zellen im Körper. Wenn die DNA-Reparatursysteme nicht ausreichen und der DNA-Schaden bestehen bleibt, kommt es zur Apoptose der Zelle. Insbesondere das p53-Protein ist in der Lage, die Transkription apoptogener Faktoren wie Bax, Fas-Rezeptor, DR-5 usw. zu induzieren.

4) Perforin Granzym. Zytotoxische T-Lymphozyten (Killer-T-Zellen) induzieren mithilfe des Proteins Perforin die Apoptose von Zielzellen (z. B. infizierten Zellen). Durch die Polymerisation bildet Perforin Transmembrankanäle in der Zytoplasmamembran der Zielzelle, durch die vom T-Killer – einer Mischung aus Serinproteasen – abgesonderte Granzyme (Fragmentine) in die Zelle gelangen. Der Hauptbestandteil dieser Mischung ist Granzym B, ein proteolytisches Enzym, das Caspase 3 aktiviert.

Die Bedeutung von Apoptose-Regulatorproteinen für die Entwicklung des Körpers und pathologische Prozesse

Bcl-2 erforderlich, um die Lebensfähigkeit von Lymphozyten, Melanozyten, Darmepithel und Nierenzellen während der Embryonalentwicklung aufrechtzuerhalten.

Вcl-x notwendig für die Hemmung des Zelltods in der Embryogenese, insbesondere im Nervensystem.

Bax notwendig für die Apoptose von Thymozyten und die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Spermien während ihrer Entwicklung.

S. 53 ist ein Tumorsuppressionsgen, spielt daher keine besondere Rolle in der Embryogenese, ist aber für die Unterdrückung des Tumorwachstums unbedingt notwendig.

Eine erhöhte Synthese des vom bcl-2-Gen kodierten Proteins führt zur Unterdrückung der Apoptose und damit zur Entstehung von Tumoren; Dieses Phänomen wurde bei follikulären B-Zell-Lymphomzellen festgestellt.

Bei lymphoproliferativen Erkrankungen und systemischen Lupus erythematodes-ähnlichen Erkrankungen bei Mäusen kommt es zu einer Beeinträchtigung der Funktion des Fas-Liganden oder des Fas-Rezeptors.

Erhöhte Synthese Fas-Ligand verhindert die Abstoßung des Transplantats.

Apoptose ist Teil des pathologischen Prozesses, wenn Zellen mit Adenoviren, Baculoviren, HIV und Influenzaviren infiziert werden.

Eine Hemmung der Apoptose in der Wirtszelle wird während einer anhaltenden Infektion, in der Latenzzeit und bei verstärkter Replikation von Adenoviren, Baculoviren, möglicherweise Herpesviren, dem Epstein-Barr-Virus und HIV, einer Aktivierung der Apoptose in Zellen des Immunsystems beobachtet trägt zur Verbreitung des Virus bei.

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